病理实验室中聚合酶链式反应 (PCR) 的应用与科研型 PCR 存在两大根本区别： 质量和临床专业知识。这两点对于做出临床诊断至关重要，而临床诊断又需要病理实验室不同分支开展的一系列检测结果的支持。 在科研实验室中，PCR 结果通常用于验证实验结果。要充分理解这些差异，需要在高质量的病理实验室环境中积累经验，才能真正体会到质量及其普遍性的必要性。

我的经历

以下文字基于我在科研和常规实验室 32 年的经验，我将 PCR 作为解答各种问题的工具。PCR 并非简单的检测方法——它非常复杂，需要实验室保持一丝不苟的清洁卫生，具备故障排除能力，并且需要为 PCR 的主要步骤设置专门的区域（这将在以后的文章中详细介绍）。

病理学 PCR 和研究 PCR 的主要区别

还有很多我没列出的，但我尽量写一篇简短精炼的文章！

值得注意的是，在 COVID-19 大流行高峰期，世界卫生组织不得不温和地提醒新采用高通量 PCR 技术的人员（其中可能包括一两位慷慨地提供研究技能、资源和场地的研究人员），务必阅读该死的说明书！

控制

每次 PCR 反应都必须包含这些对照。这些对照包括一个已知的阳性反应和一个已知的阴性反应。在这些对照反应中，您需要加入等体积的已知阳性或阴性对照物，而不是患者核酸提取物。

预期这些步骤能够成功。如果失败，则该次运行结果应视为无效。此时，您需要排查问题并重复检测部分或全部患者样本。

控制 PCR 反应环境的污染至关重要，污染源包括反应体系的设置环境、从患者样本中提取患者核酸的环境以及将两者混合的环境。您无需担心 PCR 后环境的污染控制，因为在大多数常规高通量病理实验室中，PCR 循环结束后通常不会打开反应^{管 。}

在科研环境中，很少有空间能够将 PCR 步骤进行适当的物理分隔（一个完善的分子检测实验室需要多个房间、单向工作流程和专用空调），因此这些步骤通常在实验台上进行，而且彼此距离很近。科研中的对照实验通常更侧重于确保实验的成功，而不是 PCR 反应的成功 ^。

过程

病理实验室通常不会照搬勉强完成的实验记录本上的方法（有时甚至会根据实际情况进行一些调整），也不会照搬已发表的研究论文中几乎完全相同的试剂盒配方，而是依赖于每种目标靶标的商业化 PCR 试剂盒附带的单一版本、经过版本控制和批准的“使用说明”（IFU）。 ³ 这份文件不仅提供了实验方法，还包含其他信息，例如如何制备样本。此外，实验室还会提供商业化的核酸提取方法（同样需要一份使用说明），而不是科研环境中常用的那些操作繁琐、通量较低的提取方法。

这里提供一个链接，其中包含众多 SARS-CoV-2 RT-PCR 试剂盒之一的使用说明示例： https://www.bgi.com/wp-content/uploads/sites/2/2021/04/EUA200034-S003.Instructions-for-Use.03292021.pdf

再次强调，整个流程的标准化是为了保证质量，并产生值得信赖的结果。

购买试剂盒意味着您已为以下保证付费：质量控制的成分；经过测试的引物、探针和方法；及时交付冷链监控的、计划数量的试剂盒；按照公司规定使用时预先评估的测试灵敏度；检查最合适的测试样本类型；了解热循环仪中编程的 PCR 循环条件；以及已评估的其他靶标，因此我们有充分的证据证明该测试仅检测其声称检测的内容。

有时，使用说明书 (IFU) 会列出与该测试兼容的特定仪器，因为并非所有的“PCR 仪”（热循环仪）和核酸提取平台都相同。有些试剂盒专用于单一分析仪（一种大型的、会发出蜂鸣声和闪烁指示灯的样本处理、核酸提取和 PCR 扩增一体机）。这些专用试剂盒只能与该仪器配合使用，并且必须严格按照说明书操作；否则，公司将不再认可其试剂盒所对应的检测结果，也不会再为使用该试剂盒的实验室提供支持。

周期数

PCR 反应的循环次数在试剂盒的使用说明书（IFU）中明确规定，该数值基于以往的 PCR 研究。最大循环次数也可能被分析仪的操作系统锁定。该值与阈值循环数（C _T ） 不同 。

它们的数值几乎总是高于获得阳性结果所需的数值（3E40%）。这个高数值确保医生能够获得关于阳性^结果 强度的所有必要信息。4 非商业性 PCR 也使用同样的高循环数。

例如，检测极少量的病原体可能至关重要，以便尽早发现隔离患者感染的早期阶段。或者，利用现有检测工具的全部灵敏度，确保患者在感染后从隔离病房出院前体内不残留任何病原体痕迹。

有时很难获得阴性结果。例如，非特异性 16S 或 18S PCR 检测常常会检测到大量细菌和真菌 DNA，即使是在市售试剂盒中也是如此。因此，结果可能会被“限制”——例如，任何超过 28 个循环的结果都可能被认为与临床无关。虽然目标 DNA 确实存在，但如果检测结果不是非常明显的阳性，则可能仅仅是“背景”物质。

结果解读

如上所述，PCR 检测结果呈阳性可能只是患者诊断的一部分。有些结果需要结合具体情况进行仔细解读。

大多数 PCR 检测无法告诉你目标病原体是否正在复制或具有传染性。通常情况下，它确实具有传染性。可检测到的病原体核酸不会凭空出现。尽管如此，最终结果报告中可能会提及这一点。

实验室的另一项职责是确保检测结果符合预期。与科研不同，科研中通常处理的是已知存在且数量充足的样本，而感染患者的诊断则可能在缺乏其他实验室证据的情况下，高度依赖 PCR 检测结果。

对 PCR 反应、对照、该次反应中的其他阳性和阴性结果以及 _Ct 值等指标的监测，都会影响最终报告给医生的结果。有时可能还需要电话沟通！报告也可能指出，阴性结果可能与样本的性质、时间、样本量或质量，或者是否存在 PCR 抑制物质有关。

此外，如果没有大量的额外工作和特定的方法，PCR 本身并不具备定量能力，因此它无法准确地告诉你目标分子的数量。你无法仅凭一个数值得出“检测到”或“未检测到”以外的任何结论。

质量

质量是病理实验室的一个重要议题，但在许多研究机构中却并非如此。在一个运转良好的人类标本检测环境中，质量控制（QC）、质量保证（QA）、内部质量、外部质量以及所有这些质量的管理都属于更高层次的范畴。

下图列出了质量控制的关键考量因素（内圈）以及更具体的应对方法（外圈）。值得注意的是，这不仅包括测试中使用的设备和试剂，还包括人员和文档记录。员工的专业技能、沟通和满意度对于实验室的良好运作至关重要。此外，实验室及其设备的日常清洁和维护，以及对这些工作的完整记录也同样重要。

在进行质量控制工作时，时刻关注质量至关重要。质量控制很容易导致堆积如山的纸质和电子文档， 看似徒劳无功。但要做好高质量的工作——也就是实验室客户可以信赖的工作——就需要可追溯的文档记录。这关乎如何按照标准化方法完成所有工作，以及后续的检查和审核。为此预留时间是整个流程的一部分。没错，这确实需要耗费大量时间。

以上就是病理实验室和科研实验室中 PCR 技术的一些关键区别。如果你在两个领域都工作过，就会明白我的意思。希望即使你没有在这两个领域工作过，现在也能比读到本页开头时了解更多！

例外情况。

1. 您可以在 PCR 仪上进行 PCR 后分析，但需要在该环境中采取额外的质量控制措施。PCR 后分析应在单独的区域进行，并制定流程，禁止用户在回家、洗澡、换衣服（即第二天）之前设置 PCR 反应。扩增后区域被认为是“脏的”——或许用“脏的”更贴切——因为该区域可能残留 PCR 产物，这些产物可能会重新混入您的反应体系中，污染结果，导致假阳性。
2. 这篇文章充满了平均值和概括。当然， 你的研究实验室是世界上质量控制最严格的，当然， 你做的每件事都无可挑剔。但你并非平均值。
3. 病理实验室也可以使用自制或内部开发的 PCR 方法，但这些方法需要严格的控制，以弥补商业化提供的整齐小白盒和彩色试管所带来的误差。但这完全可以实现。
4. 几乎所有情况下，阳性结果的数值（称为循环阈值，或 C _{T ） 仅用于大致指示样本的阳性强度。 有很多原因不宜直接比较不同试剂盒、实验室、仪器、日期或批次之间的 C T 值， 其中一些原因已在 “PCR 假阳性问题并非问题”一文中讨论过。}