mRNA vaccines engage unconventional pathways in CD8 T cell priming.

摘要正文

由信使核糖核酸（mRNA）与脂质纳米颗粒（LNP）构成的疫苗可通过在体内诱导特异性蛋白抗原表达激活 B 细胞与 T 细胞。B 细胞可直接被抗原激活，而 T 细胞活化需专职抗原呈递细胞（APC）通过主要组织相容性复合体（MHC）分子完成抗原加工与呈递。在病毒感染、肿瘤刺激、蛋白疫苗及互补脱氧核糖核酸（cDNA）疫苗免疫过程中，向 CD8⁺T 细胞的抗原呈递高度依赖 1 型传统树突状细胞（cDC1）；该细胞亚群专职高效交叉呈递外源性抗原 ¹⁻⁴。但 mRNA-LNP 疫苗是否依赖同类机制尚未明确。本研究证实，mRNA-LNP 疫苗启动 CD8⁺T 细胞应答无需 cDC1 细胞或 WDFY4 介导的交叉呈递通路，而是可冗余利用 cDC1 与 2 型传统树突状细胞（cDC2）两类细胞。仅由 cDC1 或 cDC2 单一亚群启动的 CD8⁺T 细胞虽表型存在差异，但均可介导抗肿瘤应答并形成免疫记忆。关键发现：树突状细胞（cDC）从非造血细胞获取肽段 – MHC-I 复合物（该过程称为交叉表位转移）是启动 CD8⁺T 细胞应答的核心环节之一，且该过程依赖 I 型干扰素信号通路。mRNA-LNP 诱导的交叉表位转移效应，或可解释其能够激活针对疫苗未编码抗原的 CD8⁺T 细胞这一现象。

为应对全球新型冠状病毒肺炎（SARS-CoV-2）大流行，LNP 递送型 mRNA 疫苗已实现大规模临床应用⁵⁻⁷。早在体外实验中，研究人员利用脂质体首次证实 mRNA 可直接导入细胞并完成蛋白翻译⁸；后续体内研究验证了 mRNA 的体内递送潜力，并提出其疫苗应用前景⁹,¹⁰。编码流感血凝素（HA）的 mRNA 疫苗可在小鼠体内诱导保护性抗体应答 ¹¹；后续研究进一步证实该类疫苗能在小鼠与非人灵长类动物体内诱导 CD4⁺、CD8⁺T 细胞应答 ¹²,¹³。同理，靶向 SARS-CoV-2 的 mRNA-LNP 疫苗可在人体内诱导具有保护作用的 CD8⁺T 细胞应答 ¹⁴。

凭借在新冠防控中的显著成效，mRNA 疫苗现已进入人体抗肿瘤 CD8⁺T 细胞诱导临床试验阶段 ¹⁵。新冠疫情前的小鼠前期研究已证实，mRNA 疫苗可诱导针对肿瘤模型抗原的 CD8⁺T 细胞应答 ¹⁶；当前多项临床试验正在评估其诱导胰腺导管腺癌新生抗原特异性 T 细胞的临床价值 ¹⁵。已有研究表明，外源抗原启动 CD8⁺T 细胞可通过多条独立抗原加工通路实现，且涉及不同 APC 亚群，通路选择完全由抗原递送形式决定 ¹⁷,¹⁸。但 mRNA 疫苗体系下 CD8⁺T 细胞启动的相关机制尚未得到系统验证。

传统树突状细胞（cDC）是初始 T 细胞启动的核心 APC，分为 cDC1、cDC2 两大亚群 ¹⁹,²⁰。cDC1 是肿瘤、病毒感染、同种异体移植模型中细胞相关抗原捕获与呈递的核心 APC¹,²,²¹；基于 cDNA 与蛋白抗原的疫苗研究同样证实，cDC1 是疫苗诱导 CD8⁺T 细胞应答的必需细胞亚群 ³,⁴。但上述结论不适用于 mRNA 疫苗体系。APC 类型可显著改变疫苗免疫应答强度：例如，携带 MHC-I、MHC-II 限制性新生抗原表位的多肽疫苗可诱导小鼠纤维肉瘤 T3 细胞排斥 ²²；有效剂量下，cDC1 负责同时向 CD4⁺、CD8⁺T 细胞呈递抗原；但高剂量 MHC-II 限制性多肽会转而由 cDC2 完成抗原呈递，诱导 CD4⁺T 细胞分化为具有免疫抑制功能的 1 型调节性 T 细胞（Tr1），最终导致肿瘤排斥失效 ²²。综上，解析 mRNA 疫苗诱导 CD8⁺T 细胞应答的分子机制具备重要研究价值。

现有正电子发射断层扫描 – 计算机断层扫描生物发光成像研究已解析 mRNA-LNP 疫苗的体内生物分布特征，证实 mRNA 及其编码蛋白主要在注射部位与引流淋巴结（dLN）表达 ²⁴⁻²⁷。部分研究显示，脾脏、肝脏等远端器官的抗原表达量远低于注射部位，提示免疫启动仅发生于局部免疫位点。但上述研究未评估远端低水平抗原的免疫原性，该科学问题仍有待解答。因此，有必要开展功能性生物分布分析，明确 mRNA-LNP 免疫后抗原转运的免疫学效应。

本研究采用新型 cDC 亚群缺陷小鼠模型 ²⁸,²⁹，验证 cDC1、cDC2 与交叉呈递通路在 mRNA-LNP 诱导 CD8⁺T 细胞应答中的必要性。结果显示，mRNA-LNP 疫苗可通过多条互补抗原呈递通路激活 CD8⁺T 细胞；与依赖 cDC1 的 cDNA、蛋白疫苗不同，mRNA 疫苗诱导全身性 CD8⁺T 细胞应答完全不依赖 cDC1，而 cDC2 在体外、体内 CD8⁺T 细胞启动过程中发挥更突出作用。值得注意的是，mRNA 疫苗激活 cDC 的过程无需树突状细胞自身表达 MHC-I 分子，cDC 可直接摄取非造血细胞来源的外源肽段 – MHC-I 复合物，该过程即交叉表位转移 ³⁰,³¹。对比仅由 cDC1 或 cDC2 单一亚群启动的抗原特异性 CD8⁺T 细胞，多组学单细胞测序发现二者克隆增殖特征存在明显差异，但效应细胞分化模式总体相近；该结果与 cDC1 缺陷、cDC2 缺陷小鼠经 mRNA 疫苗免疫后均可实现肿瘤清除的表型一致。

一、mRNA 疫苗可全身性启动 CD8⁺T 细胞应答

既往研究指出，肌肉注射 mRNA-LNP 后，抗原主要在注射肌组织与引流淋巴结表达，小鼠及非人灵长类动物远端器官仅检测到微量或无法检出抗原 ²⁴⁻²⁷。但 CD4⁺、CD8⁺T 细胞仅需数百个肽段 – MHC 复合物即可被激活 ³²⁻³⁴，因此本研究系统解析 mRNA-LNP 免疫后抗原的功能性体内分布。实验采用 10μg 卵清蛋白（OVA）mRNA-LNP 肌肉注射，该剂量与既往生物分布研究一致；通过检测 OT-I 细胞在全身各类淋巴组织中的增殖水平评估全身免疫激活（扩展数据图 1a-d、2a,b）。过继转输 24h 内，初始 OT-I 细胞实现全身分布，广泛存在于外周血及全部检测淋巴组织；免疫第 2 天，外周血中 OT-I 细胞数量显著下降（扩展数据图 1b、2b），与抗原特异性淋巴细胞快速归巢至抗原暴露位点的经典结论吻合 ³⁵；免疫第 3 天，增殖型 OT-I 细胞重新出现在外周血。脾脏、外周血、淋巴结内 OT-I 细胞分裂水平无显著差异（扩展数据图 1b-d）；将 OVA mRNA-LNP 剂量降低 100 倍至 0.1μg 后，远端组织 OT-I 增殖水平与引流淋巴结无明显区别（扩展数据图 2c）。免疫第 1 天、细胞分裂发生前，所有淋巴组织内 OT-I 细胞均上调 CD69 分子，直接证实 CD8⁺T 细胞全身性启动（扩展数据图 2d,e）。上述结果表明，肌肉注射 mRNA 疫苗可在全身多类淋巴组织中同步启动 CD8⁺T 细胞应答。

为明确远端组织 OT-I 增殖是否来源于注射部位预活化 T 细胞的迁移，本研究在免疫前 6h 给予小鼠 FTY720 处理，阻断 S1PR1 介导的淋巴细胞迁出通路 ³⁶，免疫后检测 OT-I 增殖水平（扩展数据图 1e、3a-c）。阳性对照组证实 FTY720 可抑制增殖 T 细胞回流至外周血（扩展数据图 1e、3a）；但给药组肌肉免疫后第 2、3 天，脾脏、淋巴结 OT-I 增殖水平与未处理对照组无差异，证明 T 细胞活化由局部原位抗原呈递介导。

为验证注射部位肌细胞、巨噬细胞能否直接作为 APC 启动 CD8⁺T 细胞，本研究首先阻断初始 T 细胞向淋巴组织归巢（扩展数据图 1f、3d-f）。CD62L 阻断可抑制初始 T 细胞进入淋巴结，但不影响脾脏浸润 ³⁷；联合脾脏切除与 CD62L 阻断可将 T 细胞活化完全限制于外周组织 ³⁸。本研究对脾脏切除小鼠给予抗 CD62L 抗体处理，再免疫 OVA mRNA-LNP；免疫第 3 天，联合处理组 OT-I 扩增水平显著下降（扩展数据图 1f），证实初始 T 细胞必须进入淋巴器官才能完成应答启动。同时，脾脏切除 + 抗 CD62L 处理可完全消除注射部位 OT-I 细胞聚集（扩展数据图 3d,f）。该系列结果排除注射部位体细胞直接启动 CD8⁺T 细胞的可能性，明确 mRNA 疫苗诱导的 T 细胞活化全部发生于次级淋巴组织。

二、cDC1 与 cDC2 均可独立启动 CD8⁺T 细胞

为鉴定 mRNA-LNP 免疫后负责 T 细胞启动的 APC，本研究于免疫第 2 天分离引流淋巴结（dLN）与对侧淋巴结（cLN）中的 cDC1、cDC2、B 细胞进行体外共培养实验（图 1a-c、扩展数据图 4a）。未免疫小鼠淋巴结细胞无法诱导 OT-I 增殖；引流淋巴结分离的 cDC1、cDC2 均可诱导 OT-I 增殖，B 细胞无此功能；而对侧淋巴结仅 cDC2 具备抗原呈递能力（图 1a,c）。对侧淋巴结 cDC2 诱导的 OT-I 增殖强度更低，与远端组织抗原丰度下降的文献报道一致 ²⁴⁻²⁷，同时佐证远端组织具备功能性免疫原性（与扩展数据图 1 结论呼应）。

既往研究普遍认为 cDC1 是 CD8⁺T 细胞启动的核心 APC²⁻⁴，本实验体外体系中 cDC2 高效激活 OT-I 细胞的结果与传统认知存在差异，因此构建体内基因缺陷小鼠模型验证该现象。cDC1 缺陷模型采用 Δ32 小鼠，该品系 Irf8 基因 + 32kb 增强子纯合缺失 ²⁸；cDC2 缺陷模型为 Δ1+2+3 小鼠，Zeb2 基因 – 165kb 增强子 C/EBP 结合位点发生三重突变，体内完全缺失 cDC2 细胞 ²⁹。

首先，本研究利用编码 OVA 的 cDNA 疫苗免疫野生型（WT）、Δ32、Δ1+2+3 小鼠，通过 Kᵇ-SIINFEKL 四聚体染色（图 1d、扩展数据图 4b）、SIINFEKL 肽再刺激干扰素 -γ（IFNγ）酶联免疫斑点（ELISpot）实验（扩展数据图 4c）检测 CD8⁺T 细胞应答。野生型与 Δ1+2+3 小鼠均可产生强烈 CD8⁺T 细胞应答；Δ32 小鼠体内完全无法检出四聚体阳性、IFNγ 阳性 CD8⁺T 细胞，证实 cDNA 疫苗诱导 CD8⁺T 细胞应答严格依赖 cDC1。添加 AddaVax 佐剂的 OVA 蛋白疫苗实验得到完全一致结论（扩展数据图 4d,e）。综上，cDNA、蛋白抗原疫苗高效启动 CD8⁺T 细胞必须依赖 cDC1 细胞。

随后检测 mRNA-LNP 疫苗是否依赖 cDC1 诱导 CD8⁺T 细胞应答（图 1f,g）。采用编码 OVA 的 mRNA-LNP 分别免疫野生型、Δ32、Δ1+2+3 小鼠，无编码功能的空白 mRNA-LNP 作为阴性对照，通过 Kᵇ-SIINFEKL 四聚体染色定量抗原特异性 CD8⁺T 细胞。与 cDNA、蛋白疫苗完全不同，cDC1 缺陷 Δ32 小鼠经 mRNA-LNP 免疫后，CD8⁺T 细胞应答强度与野生型无统计学差异；Δ1+2+3 小鼠四聚体阳性细胞比例轻度下降，约为野生型的 60%，与体外实验中 cDC2 抗原呈递能力更强的结果吻合（图 1a-c）。为验证该结论不局限于 OVA 模式抗原，本研究采用编码肿瘤新生抗原 LAMA4 突变肽（mLama4）的 mRNA 疫苗重复实验；野生型、Δ32、Δ1+2+3 小鼠四聚体阳性细胞扩增水平无显著差异（扩展数据图 4h）。以上结果证明，mRNA-LNP 疫苗可单独以 cDC1 或 cDC2 作为 APC，高效诱导 CD8⁺T 细胞应答。

免疫第 11 天检测的四聚体阳性细胞反映 T 细胞启动、扩增、存活、迁移的综合效应，因此本研究直接检测免疫早期 CD8⁺T 细胞增殖水平。将细胞示踪紫（CTV）标记的初始 OT-I 细胞过继转输至野生型、Δ32、Δ1+2+3 小鼠，随后给予 OVA mRNA-LNP 免疫；免疫第 2 天，三种基因型小鼠 OT-I 细胞分裂次数无明显差异（图 1h-j），证实 mRNA-LNP 疫苗可冗余利用 cDC1、cDC2 完成 CD8⁺T 细胞启动。

为确认 cDC 是 mRNA 疫苗启动 CD8⁺T 细胞的必需 APC，本研究采用 CD11c-DTR 小鼠，该品系注射白喉毒素（DT）可特异性清除全部 cDC；免疫 OVA mRNA-LNP 后检测 SIINFEKL-Kᵇ四聚体阳性 CD8⁺T 细胞扩增（图 1k,l、扩展数据图 5b-f）。实验证实 DT 处理可高效、特异性清除 cDC（扩展数据图 5b-e）；DT 处理的 CD11c-DTR 小鼠四聚体阳性应答几乎完全消失，直接证明 cDC 是 mRNA 疫苗启动 CD8⁺T 细胞的必要细胞。为排除 DT 脱靶毒性干扰，构建 CD11c-DTR→SJL 骨髓嵌合小鼠；该嵌合体经 DT 处理后仅 cDC 被清除，巨噬细胞、炎性单核细胞不受影响（扩展数据图 5g-i），同样出现四聚体阳性 T 细胞扩增缺失（图 1m、扩展数据图 5d）。

最后，本研究利用 Δ32×Δ1+2+3 双敲除小鼠（体内同时缺失 cDC1 与单核细胞分化通路 ²⁹）开展验证；该小鼠经 mRNA-LNP 免疫后，CD8⁺T 细胞四聚体扩增水平正常（图 1n），说明单核细胞、单核来源细胞不参与不依赖 cDC1 的 CD8⁺T 细胞启动。综合全部数据，cDC1 与 cDC2 是 mRNA 疫苗体内启动 CD8⁺T 细胞的两大核心 APC。

三、树突状细胞自身 MHC-I 分子并非 CD8⁺T 细胞启动必需

mRNA-LNP 编码抗原的肽段可通过两种经典途径负载至 APC 表面 MHC-I 分子：APC 直接转染后的内源加工途径、交叉呈递途径 ³⁹。本团队前期证实 BEACH 结构域蛋白 WDFY4 是细胞相关抗原、免疫复合物抗原交叉呈递的必需分子⁴⁰,¹⁸；但本研究四聚体染色、IFNγ ELISpot 结果显示，野生型与 Wdfy4⁻/⁻小鼠经 mRNA-LNP 免疫后 CD8⁺T 细胞应答强度完全一致（扩展数据图 5j-l），证明交叉呈递并非 mRNA 疫苗诱导 CD8⁺T 细胞应答的主要通路。

直接呈递、交叉呈递均要求 APC 自身表达 MHC-I 分子；而交叉表位转移是一种非常规抗原呈递通路：肽段 – MHC-I 复合物先从供体细胞转移至 cDC 表面，再完成 T 细胞活化，该过程无需 cDC 自身表达 MHC-I⁴¹。为验证 mRNA-LNP 疫苗是否激活交叉表位转移通路，本研究将 Itgax-cre⁺小鼠与 B2mᵐᶠ/ᵐᶠ小鼠杂交，实现 CD11c⁺APC 内 β2 微球蛋白（由 B2m 基因编码）条件性敲除；Itgax-cre⁺B2mᵐᶠ/ᵐᶠ小鼠 cDC 表面完全缺失 H2-Kᵇ、H2-Dᵇ分子，但 B 细胞、单核细胞、巨噬细胞等其他细胞 MHC-I 表达不受影响 ¹⁸。Abelson-mOVA 肿瘤模型依赖交叉呈递通路激活 OT-I 细胞；Itgax-cre⁺B2mᵐᶠ/ᵐᶠ小鼠与 MHC-I 三重敲除小鼠（Kb⁻/⁻Db⁻/⁻B2m⁻/⁻，简写 MHC-I TKO）均无法启动 OT-I 应答（图 2a,b）。与之相反，Itgax-cre⁺B2mᵐᶠ/ᵐᶠ小鼠经 OVA mRNA-LNP 免疫后，可高效启动 OT-I 细胞增殖，应答强度与 B2mᵐᶠ/ᵐᶠ对照组无差异（图 2c-e）；检测内源性 T 细胞库得到相同结论（图 2f,g）。Itgax-cre⁺B2mᵐᶠ/ᵐᶠ小鼠体内四聚体阳性 CD8⁺T 细胞应答完整，CD44 正常上调，仅 IFNγ 阳性细胞比例小幅下降（约 10%）（图 2f,g、扩展数据图 4f）。该结果提示，mRNA 疫苗启动 CD8⁺T 细胞无需 cDC 自身表达 MHC-I，交叉表位转移通路参与免疫激活。

尽管 Itgax-cre 介导的 B2m 敲除可完全阻断肿瘤抗原交叉呈递（图 2a,b），但既往研究发现部分 cDC 仍可检出微量 MHC-I 表达 ¹⁵；此外，血清中游离 β2M 可结合细胞膜稳定 MHC-I 复合物，造成实验干扰⁴²。为彻底消除 cDC 自身 MHC-I 表达，本研究构建骨髓嵌合小鼠：供体为野生型或 MHC-I TKO 小鼠，受体为辐照清除免疫细胞、NK 细胞耗竭的 CD45.1⁺SJL 小鼠（图 2h）。实验证实脾脏全部外周 cDC、骨髓单核 – 树突状细胞前体（MDP）、普通树突状细胞前体（CDP）、pre-cDC1、pre-cDC2 均实现 99.8%~100% 供体细胞重建（扩展数据图 6a-d）。mRNA-LNP 免疫后检测 CD8⁺T 细胞应答：野生型骨髓→SJL 对照嵌合小鼠体内四聚体阳性 CD8⁺T 细胞大幅扩增（约 13%）；MHC-I TKO 骨髓→SJL 嵌合小鼠 cDC 完全无自身 MHC-I 表达，但仍可产生大量四聚体阳性 CD8⁺T 细胞（约 5%），直接证明 cDC 自身 MHC-I 分子对 mRNA 疫苗 CD8⁺T 细胞启动无必要性。

为定量评估交叉表位转移在体内 CD8⁺T 细胞活化中的贡献（保留其他抗原呈递通路完整），本研究构建两组骨髓嵌合小鼠：野生型骨髓输入 SJL 或 MHC-I TKO 受体，免疫 OVA mRNA-LNP 后检测 OT-I 增殖（图 2j,k）。野生型骨髓→MHC-I TKO 嵌合小鼠的 cDC 无法从非造血细胞捕获肽段 – MHC-I 复合物，但保留直接呈递、交叉呈递功能；该组 OT-I 增殖水平显著低于野生型骨髓→SJL 对照组，证实交叉表位转移可显著提升 CD8⁺T 细胞应答强度。Δ32 骨髓→MHC-I TKO 嵌合小鼠体内无 cDC1，仅 cDC2 承担 CD8⁺T 细胞启动功能；相较于 Δ32 骨髓→SJL 对照组，该组 OT-I 增殖下降幅度更大，说明交叉表位转移是 mRNA 疫苗中 cDC2 启动 CD8⁺T 细胞的核心通路。

已有肿瘤模型研究证实，cDC2 介导的交叉表位转移依赖 I 型干扰素信号通路⁴³，而 mRNA 疫苗可强烈激活 I 型干扰素应答⁴⁴。本研究对 Δ32 小鼠分别给予 mRNA-LNP 单独免疫、mRNA-LNP 联合 IFNAR1 阻断抗体处理（图 2l,m、扩展数据图 7a-d）；IFNAR1 阻断可显著降低 Δ32 小鼠体内四聚体阳性 CD8⁺T 细胞比例。同时，IFNAR1 阻断可抑制 Itgax-cre⁺B2mᵐᶠ/ᵐᶠ小鼠 cDC 表面 H2-Kᵇ分子的摄取（扩展数据图 7e,f）。综合上述结果，mRNA-LNP 免疫可诱导 cDC 以 I 型干扰素依赖方式摄取非造血细胞来源的肽段 – MHC-I 复合物，该过程可功能性驱动 CD8⁺T 细胞启动。

四、mRNA 疫苗激活交叉表位转移通路

上述实验提示，mRNA-LNP 免疫过程中 cDC 可从非造血细胞获取肽段 – MHC-I 复合物。本研究在 MHC-I TKO 骨髓→SJL 嵌合小鼠体内检出，免疫后 CD45.2⁺TKO 来源 cDC 表面存在微量 Kᵇ分子，未免疫对照组无该现象（扩展数据图 8a）。为严谨验证非造血细胞向 cDC 的 MHC-I 分子转移，本研究构建 B6（H-2b 单倍型）、BALB/c（H-2d 单倍型）全同种异体骨髓嵌合小鼠，覆盖全部供体 – 受体组合（图 3a）；该体系可在体内直接检测供体来源 cDC 表面异源 H-2K 等位基因。实验确认全部外周 cDC、骨髓前体细胞均实现完全供体重建（图 3b、扩展数据图 8b-d）。OVA mRNA 免疫后的 BALB/c 骨髓→B6 受体嵌合小鼠脾脏中，cDC1、cDC2 高表达供体来源 H2-Kᵈ，同时低水平获取受体来源 H2-Kᵇ分子（图 3b-e、扩展数据图 8e,f）；该体系中约 10% cDC1、20% cDC2 细胞同时高表达 H2-Kᵈ、阳性表达 H2-Kᵇ（图 3d）。该 MHC 分子转移具备受体单倍型特异性：BALB/c 骨髓→BALB/c 受体同源嵌合小鼠未检出 H2-Kᵇ转移（图 3d,e）。

全同种异体骨髓嵌合小鼠 mRNA-LNP 免疫实验证实，交叉表位转移可功能性支持 CD8⁺T 细胞启动（扩展数据图 8g,h）。同种异体嵌合小鼠 T 细胞库筛选过程复杂，最终 T 细胞受体谱与供体、受体品系均存在差异⁴⁵,⁴⁶；但 BALB/c 骨髓→B6 嵌合小鼠经 OVA mRNA 免疫后，可产生 H2-Kᵇ限制性 CD8⁺T 细胞应答，未免疫对照组无应答（扩展数据图 8g,h）。该结果与 MHC-I TKO 骨髓→SJL 嵌合小鼠 CD8⁺T 细胞活化表型完全吻合，直接证明交叉表位转移具备功能性抗原呈递能力。

五、cDC2 可介导完整抗肿瘤免疫应答

生理条件下，cDC1 缺陷小鼠无法完成肿瘤排斥 ²,²⁸；本研究证实 mRNA-LNP 疫苗可在 Δ32 小鼠体内启动 CD8⁺T 细胞，因此进一步验证该类 T 细胞的体内功能。实验采用表达膜结合 OVA 的 1956 纤维肉瘤细胞（1956-mOVA）⁴⁷，该肿瘤的清除严格依赖 cDC1 介导的 CD4⁺、CD8⁺T 细胞启动。野生型、Δ32 小鼠分别免疫空白 mRNA-LNP 或 OVA mRNA-LNP，对侧胁部皮下接种 1956-mOVA 肿瘤细胞（图 4a）。空白 mRNA 免疫组中，野生型小鼠可完全排斥肿瘤，Δ32 小鼠肿瘤持续生长，与 1956-mOVA 肿瘤清除依赖 cDC1 的经典结论一致；OVA mRNA-LNP 免疫可完全抑制野生型、Δ32 小鼠体内肿瘤生长（图 4b,c），证明 cDC2 单独启动的 CD8⁺T 细胞具备完整抗肿瘤效应功能。

除效应阶段功能外，本研究对比 cDC1、cDC2 分别启动的 CD8⁺T 细胞记忆应答特征（扩展数据图 9）。野生型、Δ32、Δ1+2+3 小鼠第 0、7 天免疫 OVA mRNA-LNP，二次免疫 5~6 周后检测记忆 CD8⁺T 细胞。三种基因型小鼠 SIINFEKL-Kᵇ四聚体阳性细胞比例相近，且均低于免疫第 11 天峰值，符合效应 T 细胞收缩规律；四聚体阳性细胞中，Δ32 小鼠 CD127⁺记忆细胞比例高于 Δ1+2+3 小鼠（扩展数据图 9b,c）。二次免疫 6 周后，将等量无关肽段负载（CTV 低荧光）、SIINFEKL 肽段负载（CTV 高荧光）的 CD45.1⁺脾细胞混合后过继转输，开展体内细胞毒实验；转输 16h 后，野生型、Δ32、Δ1+2+3 小鼠靶细胞杀伤效率均接近 100%，Δ1+2+3 小鼠杀伤效率轻微下降，与该品系脾脏、淋巴结内四聚体阳性 CD8⁺T 细胞数量偏低直接相关（扩展数据图 9d-g）。综上，cDC1、cDC2 均可诱导功能性记忆 CD8⁺T 细胞，但二者在细胞数量、表面表型上存在细微差异。

六、cDC1 与 cDC2 启动产生特征性 CD8⁺T 细胞转录与克隆谱

为明确启动抗原的 cDC 亚群是否改变 CD8⁺T 细胞转录组、T 细胞受体（TCR）克隆特征，本研究对 OVA mRNA-LNP 免疫后野生型、Δ32、Δ1+2+3 小鼠脾脏 Kᵇ-SIINFEKL 四聚体阳性 CD8⁺T 细胞开展单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）与 TCR 测序（TCR-seq）；空白 mRNA 免疫、OVA mRNA 免疫野生型小鼠四聚体阴性 CD8⁺T 细胞作为对照。质控后共保留 58461 个单细胞转录组，其中 78.7% 细胞成功匹配成对 TCRαβ 序列。降维无监督聚类共划分 11 个细胞亚群，体现抗原特异性 T 细胞高度异质性（图 5a、扩展数据图 10）。

四聚体阳性细胞内，依据细胞毒性基因 Prf1、Gzmb 表达划分效应细胞亚群；效应细胞进一步分为终末效应细胞（高表达 S1pr5、Klrg1）、Il7r 阳性效应细胞（图 5b）。Mki67 阳性增殖细胞具备效应细胞特征，同时特异性表达周期相关基因：G1 期 Mcm2、S 期 Hist1h2ae、G2/S 期 Ccnb2 与 Cenpa。本研究同时鉴定出高表达 Tcf7、Slamf6 的干细胞样记忆亚群；耗竭样细胞特征性高表达 Lilrb4a、Lilrb4b、Tox、Cd38，同时表达 Pdcd1、Lag3 等抑制性受体。干扰素信号相关基因簇由 Isg15、Ifit3、Ifit1 高表达定义。四聚体阴性细胞包含初始 / 中枢记忆细胞（Sell、Ccr7、Lef1、Tcf7）、Gzmm、Ifngas1 阳性记忆样亚群（图 5b,c）。

关键结果：Δ1+2+3 小鼠增殖型效应细胞占比显著高于野生型、Δ32 小鼠（图 5c）。TCR 克隆分析显示，野生型、Δ32 小鼠以克隆扩增终末效应细胞为主；Δ1+2+3 小鼠细胞克隆偏向增殖型、干细胞样亚群（图 5d）。克隆规模＞20 的超高扩增克隆中，Δ1+2+3 小鼠克隆具备更强增殖、干细胞样特征，野生型、Δ32 小鼠克隆以终末效应表型为主（图 5e）。综上，抗原特异性 CD8⁺T 细胞存在显著表型异质性与克隆多样性；Δ1+2+3 小鼠 T 细胞富集增殖、干细胞样亚群，野生型、Δ32 小鼠以终末效应细胞为优势亚群，二者表型特征存在明确区分。

讨论

本研究系统解析 mRNA-LNP 疫苗启动 CD8⁺T 细胞的核心机制，获得四项关键结论：第一，cDC1、cDC2 可冗余作为淋巴组织内启动 CD8⁺T 细胞的 APC，巨噬细胞、单核细胞谱系及注射部位体细胞不参与该过程；第二，尽管 mRNA-LNP 定点肌肉注射，仍可在全身多处淋巴组织同步启动 CD8⁺T 细胞；第三，交叉表位转移是 CD8⁺T 细胞活化的核心通路，非造血细胞来源肽段 – MHC-I 复合物直接转移至 cDC 表面，该过程严格依赖 I 型干扰素；第四，交叉表位转移通路可解释新冠 mRNA 疫苗促进抗肿瘤免疫的最新报道，具备重要临床转化价值⁴⁸。

本研究最核心发现：mRNA-LNP 疫苗诱导 CD8⁺T 细胞应答完全依赖 cDC（cDC1 或 cDC2 任一亚群即可完成）。既往研究证实注射部位肌细胞、巨噬细胞均可表达抗原 ²⁶,⁴⁹，但本实验排除该类细胞直接启动初始 CD8⁺T 细胞的能力；通过脾脏切除、CD62L 阻断实验证实，初始 T 细胞必须浸润次级淋巴组织才能完成活化，注射部位无独立启动功能。尽管单核细胞、巨噬细胞高效摄取 mRNA-LNP，但 cDC 缺失小鼠体内无法诱导 CD8⁺T 细胞应答；同时单核细胞、单核来源细胞敲除不影响免疫应答，证明单核谱系细胞非必需。综上，mRNA-LNP 诱导的抗原表达于外周组织后，必须经 cDC 迁移至淋巴器官，才能与 CD8⁺T 细胞发生相互作用完成启动。

mRNA 疫苗可冗余利用 cDC1、cDC2 启动 CD8⁺T 细胞，该特征与蛋白亚单位疫苗、cDNA 疫苗、病毒载体、实体肿瘤模型完全不同；上述传统免疫策略均依赖 cDC1 介导的交叉呈递通路发挥作用 ¹⁻⁴。近期一项研究指出，静脉注射 mRNA-LNP 疫苗诱导 CD8⁺T 细胞依赖 cDC1，且 I 型干扰素会抑制该应答强度⁵⁰。cDC 依赖差异的潜在诱因包括：疫苗递送途径、LNP 脂质组分、全身细胞因子应答强度与质量。已有文献证实，静脉注射 mRNA-LNP 会诱发更强全身炎症，同时导致心脏等器官异常抗原沉积⁵¹；后续研究需系统解析递送环境、脂质配方、I 型干扰素信号对 cDC 功能、CD8⁺T 细胞启动的调控规律。

第二项重要结论：mRNA-LNP 疫苗具备全身性免疫激活能力，可拓宽参与应答的 CD8⁺T 细胞库。既往生物分布研究仅聚焦组织抗原表达丰度，仅证实注射部位抗原最高，未评估远端组织免疫原性。本研究证实全身多处淋巴组织同步发生 CD8⁺T 细胞启动。初始 CD8⁺T 细胞在单个淋巴结内循环周转需 12~20h，随后回流至外周循环⁵²，抗原暴露时间窗口狭窄；mRNA-LNP 瞬时表达抗原，全身性同步启动可最大化招募抗原反应性 T 细胞，提升免疫应答规模。

相较于传统疫苗平台，mRNA 疫苗中 cDC 采用的抗原加工通路具备独特性：除经典直接呈递、交叉呈递外，交叉表位转移贡献大量 CD8⁺T 细胞活化信号，使免疫应答不依赖单一加工通路。mRNA 疫苗 CD8⁺T 细胞启动完全不依赖 WDFY4（细胞相关抗原交叉呈递必需蛋白）⁴⁰；多类骨髓嵌合小鼠实验证实，自身缺失 MHC-I 分子的 cDC 仍可高效启动 CD8⁺T 细胞，证明 cDC 捕获外源成熟肽段 – MHC-I 复合物。该交叉表位转移过程依赖 I 型干扰素信号，与肿瘤模型中 I 型干扰素调控交叉表位转移的报道完全吻合⁴³。

APC 类型直接决定 T 细胞应答整体特征 ²²,³⁸。针对 CD4⁺T 细胞，cDC1、cDC2 启动产生的应答存在显著功能差异，是机体抵抗病原体的核心基础：刚地弓形虫感染模型中，仅 cDC1 分泌 IL-12，诱导保护性 1 型辅助 T 细胞应答；多形螺旋线虫感染时，仅 cDC2 诱导保护性 2 型辅助 T 细胞应答 ²⁹,⁵³。但不同 cDC 亚群启动对 CD8⁺T 细胞功能质量的调控规律尚未得到系统解析。绝大多数生理场景（病毒感染、实体肿瘤、传统疫苗）中，仅 cDC1 负责 CD8⁺T 细胞启动，无法直接对比两类 cDC 的功能差异。近期研究发现，肿瘤微环境中 cDC2 可通过交叉表位转移少量参与 CD8⁺T 细胞应答，但未对比单一 cDC1、单一 cDC2 启动的 T 细胞表型差异⁴³,⁵⁴。本研究利用 cDC1、cDC2 缺陷小鼠实现单一亚群独立启动，完成直接对比。单细胞转录组分析揭示表型差异：cDC1 单独启动产生高扩增克隆，增殖潜力更强；cDC2 单独启动诱导高 IL-7R 表达记忆细胞。cDC2 启动的 CD8⁺T 细胞可完整介导肿瘤清除，记忆 T 细胞生成数量、细胞毒活性与 cDC1 启动组接近；但其在慢性免疫应答中的长期保护效能仍有待验证。

近期临床研究发现，编码新冠刺突蛋白的 mRNA-LNP 疫苗可在人与小鼠体内增强免疫检查点阻断疗法的抗肿瘤 CD8⁺T 细胞应答，该效应依赖 I 型干扰素，但肿瘤抗原特异性应答的分子机制尚不明确⁴⁸。本研究证实，mRNA-LNP 免疫后 I 型干扰素促进 cDC1、cDC2 完成肽段 – MHC-I 复合物交叉表位转移；关键特征：交叉表位转移摄取的肽段 – MHC-I 复合物无抗原肽特异性⁵⁵。据此推测，mRNA-LNP 免疫可诱导 cDC 捕获各类非造血细胞、肿瘤细胞表面的肽段 – MHC-I 复合物，拓宽疫苗呈递抗原谱。该机制可为提升疫苗效力、解析 mRNA 疫苗相关免疫病理损伤提供全新理论依据。

在线补充材料

参考文献

实验方法

实验动物

骨髓嵌合小鼠构建

1. CD11c-DTR 骨髓嵌合小鼠：CD45.1⁺ SJL 受体小鼠接受 1050 rad X 射线致死辐照；辐照后 12~18h 内，尾静脉注射≥5×10⁶个 CD11c-DTR 供体小鼠骨髓细胞。
2. 野生型 / MHC-I TKO→SJL 骨髓嵌合小鼠：SJL 受体小鼠腹腔注射 100μg 抗 NK1.1 抗体（PK136，Leinco，N123）清除 NK 细胞；次日给予 1050 rad 致死辐照；辐照 12~18h 内尾静脉注射≥5×10⁶野生型或 MHC-I TKO 供体骨髓细胞。
3. 野生型 /Δ32→SJL/MHC-I TKO 骨髓嵌合小鼠：SJL 或 MHC-I TKO 受体小鼠 1050 rad 致死辐照；12~18h 内尾静脉注射≥5×10⁶野生型或 Δ32 供体骨髓细胞。
4. B6、BALB/c 同种异体骨髓嵌合小鼠：B6 受体辐照剂量 1050 rad，BALB/c 受体 650 rad；收集 B6 或 BALB/c 供体骨髓，ACK 裂解液去除红细胞；生物素标记抗 CD4、抗 CD8β 抗体孵育去除 T 细胞，磁珠阴性分选纯化骨髓细胞；尾静脉注射≥5×10⁶纯化骨髓细胞至辐照受体。

抗体与流式细胞术

阴性分选生物素标记抗体

荧光标记流式抗体

体内 IFNAR1 阻断

抗原呈递细胞制备

脾脏、淋巴结、骨髓单细胞制备

1. cDC 染色：脾、淋巴结胶原酶 – DNase 消化，70μm 滤网过滤，直接染色。
2. CD8⁺T 细胞染色：脾、淋巴结、外周血机械研磨，70μm 滤网过滤，ACK 裂解红细胞后染色。
3. 骨髓：股骨、胫骨、骨盆研磨制备悬液，MACS 缓冲液重悬，70μm 过滤，ACK 裂解红细胞后染色。

肌肉免疫细胞分离

免疫方案

mRNA-LNP 疫苗

cDNA DNA 疫苗

AddaVax 佐剂蛋白疫苗

坏死肿瘤抗原

体外、体内 OT-I 启动实验

OT-I 细胞分离

体外共培养实验

体内抗原呈递实验

T 细胞迁出阻断

初始 T 细胞归巢阻断

CD8⁺T 细胞四聚体染色

IFNγ 酶联免疫斑点（ELISpot）

免疫荧光组织成像

肿瘤体内实验

体内细胞毒杀伤实验

统计学分析

单细胞分离、文库构建与测序

分离野生型、Δ32、Δ1+2+3 小鼠 OVA 四聚体阳性脾细胞，0.04% BSA-PBS 洗涤；每只小鼠细胞哈希寡核苷酸（HTO）标记实现多样本混测；GEM 生成、条码标记、GEM-RT 逆转录、磁珠纯化后合成 cDNA；纯化 cDNA 扩增 11~16 循环，SPRIselect 磁珠纯化；Bioanalyzer 检测 cDNA 浓度；全长 cDNA 开展 V (D) J TCR 富集扩增；基因表达文库、TCR 富集文库、表面蛋白特征文库严格按照 10x Genomics Chromium GEM-X 单细胞 5′试剂盒（v3 化学双索引，表面蛋白与免疫受体图谱配套条码）说明书构建，依据 cDNA 浓度调整 PCR 循环数。

测序试剂：Chromium GEM-X Single Cell 5′ Kit v3、配套芯片、小鼠 TCR 扩增试剂盒、双索引 TT/A 试剂盒、特征条码试剂盒；KAPA 文库定量试剂盒 qPCR 精确定量文库浓度，适配 Illumina NovaSeq6000 测序仪；标准化文库 NovaSeqX S4 芯片 XP 流程测序，测序读长 151×10×10×151；基因表达文库目标测序深度 50000 reads / 细胞，V (D) J、特征文库 5000 reads / 细胞。

10x CellRanger v.9.0.1 比对定量，小鼠参考基因组 refdata-gex-mm10-2020-A，V (D) J 参考库 refdata-cellranger-vdj-GRCm38-alts-ensembl-7.0.0。

单细胞转录组与 TCR 克隆分析

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