Contents
Efficacy, Immunogenicity, and Safety of Modified mRNA Influenza Vaccine
摘要
背景
方法
结果
结论
流感继续在各年龄段人群中引发广泛疾病。1 在美国2022-2023年流感季，流感估计导致18至64岁成年人中13万人住院，超过5500人死亡。1 同一季节，疫苗接种估计在该年龄段预防了280万例流感相关疾病、2.2万例住院以及超过1000例死亡。2 然而，流感疫苗的总体有效性并不理想，2004至2023年间其有效性在10%至60%之间波动。3 疫苗抗原与流行流感病毒之间的匹配度会影响疫苗效力，而流感病毒因遗传不稳定会快速变异。4,5 由于特定菌株的免疫力会随时间减弱，且为了更好地匹配流行菌株，因此需要每年生产疫苗。6
基于核苷修饰信使RNA（modRNA）的疫苗已成为疫苗研发中不可或缺的一部分。在2019年冠状病毒病（新冠肺炎）大流行期间，获得许可的、包裹在脂质纳米颗粒中的modRNA疫苗（编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）刺突蛋白）展现出了高效性。7,8在基于modRNA的疫苗中，部分核苷被天然存在的修饰核苷取代，这会减少先天免疫激活并增加翻译效率。9与传统的基于鸡蛋的疫苗相比，modRNA平台具有独特优势，包括可大规模生产、疫苗能与目标流感毒株直接匹配、毒株选择到疫苗生产之间的制造时间可能更短，以及不存在可能降低效力的鸡蛋适应性突变风险。10-13
一种四价修饰RNA流感疫苗候选物在1-2期研究中显示出良好的免疫原性和可接受的安全性。14我们开展了一项3期 efficacy试验——一项评估修饰RNA疫苗针对流感的安全性、耐受性和免疫原性的研究（辉瑞C4781004试验），旨在确定该修饰RNA疫苗与标准四价疫苗相比，在预防流感方面的相对 efficacy。
方法
参与者与试验设计
这项随机、盲法试验在2022-2023年流感季期间，在美国的242个研究中心、南非的5个研究中心和菲律宾的1个研究中心招募了参与者。试验设计旨在评估一种修饰RNA疫苗的有效性、安全性和免疫原性，该疫苗编码四种流感毒株（两种甲型流感毒株和两种乙型流感毒株）的血凝素，这是世界卫生组织（WHO）针对该流感季推荐的（详见《补充附录》表S1，可在NEJM.org查阅本文全文）。
我们将18至64岁的健康或病情稳定参与者按1:1的比例分组，分别接受肌肉注射modRNA疫苗（剂量为30μg）或灭活对照疫苗（FLUZONE [赛诺菲巴斯德]）。参与者在试验前6个月内不得接种过任何流感疫苗。有关资格标准和试验伦理实施的详细信息见补充附录。该试验已获得各研究机构审查委员会的批准，所有参与者均提供了书面知情同意书。
监督
有效性
我们的主要目标是根据方案定义，证明modRNA疫苗相较于对照疫苗在预防实验室确诊的、与流感样疾病相关的流感方面具有非劣效性和优效性。相对疫苗效力定义为，与接种对照疫苗的参与者相比，接种modRNA疫苗后至少14天出现首次流感样疾病的参与者比例的相对降低幅度。
次要疗效终点包括：由所有抗原匹配株、不匹配株以及每种匹配株引起的首次实验室确诊流感样疾病发作；培养确诊的流感相关疾病（任何毒株）；世界卫生组织（WHO）和美国疾病控制与预防中心（CDC；修正定义）所定义的实验室确诊流感；以及所有地方或中央实验室确诊的流感样疾病病例。探索性终点为接种后至少7天发生首次流感样疾病的相对疫苗效力。病例定义详见表S2；有关疾病监测和病毒检测的详细信息详见补充附录。
免疫原性
我们在约4000名参与者（免疫原性亚组）中评估了免疫原性。在接种疫苗前以及接种后4周和6个月采集血液样本。此外，还从免疫原性亚组中约125名参与者那里采集了可选血液样本，以评估细胞介导的免疫反应（外周血单核细胞[PBMC]亚组）。次要免疫原性终点是证明modRNA疫苗的免疫反应不劣于对照疫苗。
免疫原性终点包括血凝抑制（HAI）试验中滴度的几何平均比值，以及接种后4周各毒株血清转化参与者百分比的组间差异。HAI试验使用的是卵源和细胞源流感病毒，对应2022-2023年北半球流感季节相应疫苗中世界卫生组织推荐毒株（甲型和乙型流感各两种毒株）的卵基和细胞基试验（表S1）。
另一个次要免疫原性终点是接种后4周modRNA疫苗引发的免疫反应。在一项探索性分析中，研究了接种后6个月免疫反应的持久性。其他终点包括各时间点的血凝抑制（HAI）几何平均滴度（GMT）、各时间点HAI的几何平均增长倍数（即接种后滴度与接种前滴度比值的几何平均值），以及各时间点每种毒株的HAI血清转化率，还有接种前和接种后4周每种毒株的HAI滴度至少为1:40的参与者百分比。
探索性免疫原性终点包括组间细胞介导的免疫反应差异（每个外周血单个核细胞采集时间点的血凝素特异性CD4+和CD8+T细胞的几何平均频率），以及通过细胞内细胞因子染色测定法确定的、从接种前到每个接种后外周血单个核细胞采集时间点的血凝素特异性CD4+和CD8+T细胞频率的几何平均倍数增加。
安全性
统计分析
预计入组约17,600名参与者，我们确定，根据方案定义，首批152例实验室确诊流感病例将使该试验具备约80%的检验效能，以满足主要疗效终点，即证明modRNA疫苗相对于对照疫苗具有非劣效性，单侧I类错误为2.5%；对于相同的终点，212例流感样疾病病例将提供约90%的检验效能（有关样本量确定的详情见补充附录）。
对疗效和免疫原性终点的假设检验采用了分层方式进行，其中主要疗效有两个假设（非劣效性和优效性），次要免疫原性终点有八个假设（每个毒株有两个假设）（表S3）。
对改良意向性治疗人群中可评估的疗效数据进行了疗效终点分析。可评估疗效人群（与主要疗效目标相关的假设检验的主要人群）包括所有在指定组别中接种疫苗且在接种后14天内无重大方案偏离或流感样疾病的参与者（表S4）。疗效目标的主要分析基于数据截止日期（2023年3月17日）前发生的144例流感样疾病。还根据赞助商对美国疾病控制与预防中心（CDC）流行病学趋势的审查，在流感季结束日期（2023年5月1日）前进行了分析。
对于主要疗效目标，我们估算了相对疫苗效力以及双侧95%置信区间。相对疫苗效力的计算公式为1−（modRNA组的首次流感样疾病发作数/该组总人数÷对照组的首次流感样疾病发作数/该组总人数）。疗效分析采用条件精确检验，其依据是在两组首次发作病例总数已知的情况下，modRNA组首次流感样疾病发作病例数的二项分布。在累计至少130例由任何毒株引起的可评估流感样疾病首次发作病例后，对主要疗效目标进行序贯评估。未计算相对疫苗效力的P值。
首先对modRNA疫苗与对照疫苗针对流感样疾病的非劣效性 有效性进行测试，随后进行优效性测试。若相对疫苗有效性的双侧95%置信区间下限对于非劣效性而言超过-10个百分点，对于优效性而言超过0个百分点，则判定为具有非劣效性或优效性。对于次要和探索性 有效性目标，需估算相对疫苗 有效性及双侧95%置信区间。
在具有可评估免疫原性数据的参与者人群中进行了免疫原性分析。我们通过对两组未调整的血凝抑制（HAI）滴度的均值、平均倍数增长（早期值到后期值）和平均比值分别取指数，计算了几何平均滴度（GMTs）、血凝抑制几何平均倍数增长以及几何平均比值。采用Student t分布计算总体均值的95%置信区间。血清转换的定义为：接种前血凝抑制滴度低于1:10且接种后滴度至少为1:40，或接种前血凝抑制滴度至少为1:10且接种后滴度至少增长4倍。
由于该方案在评估次要终点或其他终点（除了用于非劣效性的次要免疫原性终点之外）时未包含多重性校正的条款，因此结果以点估计值和95%置信区间的形式报告。这些区间的宽度未针对多重性进行调整，因此对于与免疫原性非劣效性目标无关的次要终点，不应使用这些区间来推断其明确的有效性。
若在可评估疗效人群中两个主要疗效目标均达成，则基于鸡蛋源病毒的血凝抑制试验结果，按毒株（依次为A/H3N2、A/H1N1、B/山形、B/维多利亚）采用分层方式对免疫应答的非劣效性进行假设检验，随后针对基于细胞源病毒的血凝抑制试验结果对每种毒株进行检验。若组间比较的双侧95%置信区间下限满足两项标准——modRNA疫苗相较于对照疫苗的疗效数值大于0.67（1.5倍系数边际），且疫苗间血清转换参与者百分比差异（modRNA疫苗减去对照疫苗）的数值大于-10个百分点，则判定该毒株具有非劣效性。外周血单个核细胞分析数据以几何平均百分比进行描述性呈现，同时汇总从接种前到每个接种后时间点，基于细胞的血凝素特异性CD4+和CD8+ T细胞的几何平均倍数增加情况。
安全性分析为描述性分析。在反应原性电子日记亚组中评估反应原性事件，在安全性人群中评估其他安全性事件。
结果
参与者
有效性
免疫原性
由于在血凝抑制试验的几何平均比值方面未显示出非劣效性，且在基于鸡蛋的病毒血凝抑制试验中，四种疫苗株的血清转换也未显示出非劣效性，因此预先指定的分层非劣效性测试未继续进行；所以，基于细胞的病毒血凝抑制试验结果仅作描述性呈现。基于细胞的试验结果与基于鸡蛋的试验结果一致，相关内容见图S6至S9。
在可评估的免疫原性人群中，两个试验组的血凝抑制试验（HAI）几何平均滴度（GMTs）从接种前到接种后4周均有所上升（图S10）。接种后的GMTs显示，A型毒株高于B型毒株；在所有试验组中，针对A型毒株，修饰RNA疫苗的GMTs高于对照疫苗，而针对B型毒株则低于对照疫苗。
接种疫苗前，在可评估免疫原性人群中，超过50%的参与者对A/H3N2、A/H1N1和B/山形株的既往血凝抑制（HAI）滴度至少为1:40，且modRNA组和对照组之间的这一比例均衡。接种疫苗后4周，两个试验组中所有毒株的HAI滴度至少为1:40的参与者比例均有所上升。在两个试验组中，四种毒株中的三种（A/H3N2、A/H1N1和B/山形株）的HAI滴度至少为1:40的参与者比例的95%置信区间下限均超过70%，这表明两种疫苗在大多数参与者中均引发了针对流感的血清保护反应。
接种后1周，在所有毒株中，修饰RNA组的CD4+和CD8+ T细胞干扰素-γ表达的几何平均因子增幅以及应答频率均高于对照组，尤其是两种B株的CD8+ T细胞表达（图4）。这种模式在接种后4周和6个月仍保持不变（图S11）。
安全性
在安全性数据集的18388名参与者中，截至安全性数据截止日期（2023年9月29日），modRNA组6.7%的参与者和对照组4.9%的参与者在接种后4周内报告了不良事件（图S12）。研究者认为与疫苗相关的不良事件在modRNA接种者中的报告率为3.3%，在对照组接种者中的报告率为1.4%（表S9）。modRNA组不良事件发生率较高，主要是由未纳入反应原性电子日记亚组的参与者报告的、接种后7天内发生的反应原性事件所致。
两组试验中，严重及危及生命的不良事件、严重不良事件以及导致退出试验的不良事件发生率均较低，且两组情况相似（表S10和S11）。一名modRNA疫苗接种者出现了研究者认为与疫苗相关的严重不良事件（3级接种部位反应和4级过敏反应，该事件未达到过敏反应的标准临床标准）。未报告其他过敏反应事件。
接种后6个月内，16名参与者出现了具有致命结局的不良事件（modRNA组7名，对照组9名）；研究者认为这些事件均与疫苗无关（表S12）。接种后一周内无死亡报告；接种后第8天至第4周，报告了2例死亡（均在对照组）。没有参与者确诊心肌炎或心包炎。两组中免疫或自身免疫性疾病的诊断频率相似。
讨论
在本试验中，我们评估了一种修饰RNA疫苗与已获批的流感对照疫苗在预防流感方面的相对效力。在北半球流感季，A/H3N2毒株为主要流行株，A/H1N1毒株次之，在此期间，我们展示了该疫苗在18至64岁参与者中的相对疫苗效力。15修饰RNA疫苗总体显示出效力。
在2022-2023年流感季，美国获批的流感疫苗在64岁及以下参与者中的疫苗效力约为44%至54%。16,17在同一季节对我们试验中纳入的美国获批对照疫苗进行的同期评估，使得我们能够与modRNA疫苗进行比较。在季末分析中，modRNA疫苗相较于对照疫苗28.7%的相对效力表明，modRNA疫苗的效力在60%至67%之间。
我们通过血凝抑制试验评估了血清学免疫反应，并通过细胞内细胞因子染色评估了每种疫苗的细胞介导免疫反应。接种后4周和6个月时，针对A型毒株，修饰RNA疫苗诱导的抗体反应高于对照疫苗；而针对B型毒株，修饰RNA疫苗的抗体反应与对照疫苗相当或更低。细胞介导免疫反应的检测结果显示，接种修饰RNA疫苗后1周至6个月内，CD4+和CD8+T细胞出现流感抗原特异性激活。在所有检测时间点，修饰RNA疫苗诱导的T细胞干扰素-γ表达在四种毒株中普遍更高，且在6个月时所有毒株仍可检测到细胞介导的免疫反应。
与对照疫苗相比，无论血凝抑制（HAI）检测类型如何，modRNA疫苗诱导的更高HAI抗体反应均对应着针对匹配A型毒株的更高相对疫苗效力。本试验中仅观察到2例B型毒株病例，且均为未知毒株，这一发现与同期监测数据一致。在报告的美国流感季节期间，95.4%的病例由A型流感病毒引起，其中A/H3N2占所有阳性标本的57.1%；另有报告显示A/H1N1（24.1%）和B/维多利亚系（3.8%）标本。18 此前已有研究表明，HAI检测在检测B型毒株反应方面表现不佳，这意味着该检测在预测对B型流感的保护能力方面存在不确定性。19 我们的试验并未增进我们对两种疫苗预防B型流感疾病保护作用的理解。
与对照疫苗相比，modRNA疫苗报告的反应原性事件更为频繁。然而，这些事件大多为轻中度，且通常是短暂的，两组之间的严重事件在临床上无显著差异。modRNA疫苗的安全性特征总体上与对照疫苗相似，未发现新的安全问题。不良事件总体上反映了该人群中与年龄相符的预期疾病、感染和健康状况。在6个月内，两组的严重不良事件发生率相近（约1.0%）。
该试验的局限性包括将相对疫苗效力（即比较修饰RNA疫苗与对照疫苗）而非绝对效力（即比较修饰RNA疫苗与安慰剂）作为主要终点。这种设计导致的是效力的外推，而非直接计算。此外，作为单季试验，我们展示该疫苗针对所有世界卫生组织推荐的流感毒株（A/H3N2、A/H1N1、B/维多利亚系和B/ Yamagata系）15的相对效力的能力受到了限制。尽管本试验中有四分之一的参与者存在重症流感风险，但由于这项基于美国的分析排除了某些人群，将这些研究结果外推至其他人群（儿童、免疫功能低下者、孕妇或64岁以上人群）、地区及人口统计学群体时应谨慎行事。
在新冠疫情期间，修饰核糖核酸（modRNA）疫苗平台能够快速、大量生产具有可接受安全性的有效疫苗，这一点至关重要，同时它在预防季节性呼吸道疾病（如流感）方面的潜在应用也很重要。这项随机试验表明，在18至64岁的成人中，该修饰核糖核酸疫苗对首次实验室确诊流感的预防效果与现有疫苗相当，甚至更优。这种保护效果是通过一种仅设计用于编码流感血凝素抗原的疫苗实现的，但修饰核糖核酸疫苗也有可能针对其他流感病毒抗原。修饰核糖核酸平台为流感疫苗的研发带来了希望，并可能在现有产品的基础上有所改进。
注释
作者提供的一份数据共享声明可在NEJM.org上查阅本文全文时获取。
由辉瑞公司资助。
作者提供的披露表可在NEJM.org上查阅本文全文时获取。
我们感谢所有自愿参与本试验的受试者及其护理人员；感谢各试验中心人员的贡献；感谢整个辉瑞试验团队，包括詹姆斯·巴伯、邦妮·贝克、马里奥·布朗、 Adriana Cahill、基兰·查拉加利、雷纳托·西富恩特斯、亚当·克雷格、古尔汉·德尼泽、马林·德斯纳、奥利弗·迪克森、艾米·多尔曼、索米特拉·杜贝、克里斯托弗·邓恩、卡米拉·法雷尔、玛丽亚·德尔·卡门·费尔南德斯、艾莉森·戈米利恩、杰奎琳·格里洛、基尔斯滕·格罗内、阿曼达·格里兹莫洛维奇、特蕾莎·豪格尔、丽贝卡·赫伯特、库马尔·伊兰戈万、穆尼布·伊克巴尔、埃丝特·雅库博维奇、贾冯·约翰逊、康斯坦丁诺斯·卡苏拉斯、刘欢、凯利·奥尔里、亚历山德拉·奥尼尔、卡西·奥兰蒂斯、迈克尔·帕克斯、艾莉森·佩弗、凯伦·全、瓦妮莎·拉贝、英格丽德· Lea Scully、贾纳基·尚卡兰、安妮特·谢蒂诺、海伦·史密斯、凯瑟琳·塞耶、ELISA Harkins Tull、卡拉·扬斯·范伦斯堡、米歇尔·瓦纳斯、阿姆鲁塔·文卡特拉马尼、弗娜·韦尔奇、凯利·韦特库斯-爱德华兹、刘易斯·沃特金森、苏珊·威特科、马莱特·沃尔德马里亚姆、 Bo Yule和张荣；以及ICON临床研究公司的特里西亚·纽厄尔和希娜·亨特，他们为本文先前版本提供了编辑协助。
补充材料
参考文献
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