世界卫生组织关于疫苗非临床评价的指南

© 世界卫生组织 世界卫生组织技术报告系列，第927号，2005年

附件1

世界卫生组织关于疫苗非临床评价的指南

本文件为国家监管当局（NRAs）和疫苗生产商提供了关于疫苗非临床评价的指导，概述了该领域的国际监管期望。应与疫苗临床评价指南：监管期望（1）一同阅读，以完整理解疫苗评价的全过程。疫苗是一类多样的生物产品，其非临床测试计划将取决于产品特定特征和临床适应症。因此，以下文本以指南的形式编写，而非建议。与具体疫苗相关的特定问题，指南比建议具有更大的灵活性。

引言

近期在生物技术和基础免疫学方面的进展，促使开发了一系列新型疫苗，为预防传染病带来了令人兴奋的可能性（2,3）。也在考虑对已获许可的疫苗进行改进；这些改进将带来新产品以及引入新的佐剂。然而，这些产品的复杂性和新颖性带来了科学和监管挑战，因为可能不存在关于它们的安全性、效力和质量评估的标准。产品多样性以及新方法、技术和方法随着时间的推移而发展；因此，基于可获得的最佳科学的判断应始终作为决定这些产品的非临床评价类型和范围的基础。

尽管非临床评价在疫苗候选物的整体开发中起着至关重要的作用，但目前对于这些产品的非临床评价项目缺乏有限指导。在这份指导文件中，讨论了疫苗非临床评价的一般原则，特别关注对新的和新颖疫苗的监管期望。

临床前测试是将候选疫苗从实验室转移到诊所的先决条件，包括测试的所有方面、产品表征、概念验证/免疫原性研究以及在人体进行临床测试之前对动物进行的安全性测试。在本文件的背景下，非临床评估指的是在疫苗的临床开发之前和期间进行的所有体内和体外测试。例如，当制造过程或产品配方发生变化时，或者为了进一步研究可能源自I期和II期试验或文献中描述的类似产品的潜在安全问题，可能需要进行非临床评估。

1 一般意见

非临床研究旨在定义候选疫苗的体外和体内特性，包括与安全和免疫原性相关的特性。动物的非临床研究是识别对疫苗接种者可能造成的风险的有价值的工具，并有助于规划后续针对人类受试者的临床研究方案。然而，在所有情况下，当进行动物安全测试时，都应该有明确的理由，并且研究应依照国家和国际关于保护实验动物的法律（4）、生物安全要求（5）以及良好实验室规范（GLP）（6）进行。然而，可能存在无法完全遵守GLP的情况。如果研究或研究的部分未遵守GLP，应明确非合规领域，并起草一份未合规原因的说明。

疫苗产品的潜在安全隐患包括产品固有毒性、杂质和污染物的毒性，以及疫苗成分间相互作用产生的毒性。此外，疫苗诱导的免疫反应可能导致毒性副作用。

尽管努力最大化非临床毒性研究的预测价值，但总有无法识别所有风险的可能性。应认识到动物试验在反映人类临床安全性和有效性方面的局限性，因为发病机制和免疫反应通常具有物种特异性。而且，动物试验中发现的潜在安全隐患并不一定意味着在人类中会有问题。然而，在非临床毒性研究中观察到的任何信号都应在人体临床试验中得到仔细处理，并可能需要额外的非临床测试。应当注意，动物研究中没有检测到毒性并不一定意味着疫苗在人类中会是安全的。第6节考虑了与特定类型疫苗候选物相关的潜在安全隐患。

鼓励开发和随后验证用于替代动物疫苗候选物非临床评估的体外测试，因为这可能会改善非临床测试，同时减少动物使用。

非临床测试的需求和程度将取决于所考虑的产品。例如，对于没有先前非临床和临床经验的产品，其非临床试验预期会比之前获得许可并在人体中使用的疫苗更为广泛。在某些情况下，可能不需要在启动I期临床试验之前进行临床前安全性研究。例如，在技术转让的情况下，如果可以获得最初开发疫苗的数据库，那么来自非临床桥接研究（例如物理化学表征和简化的体内研究）的数据可能是产品进一步开发的可接受基础。

建议疫苗生产商与负责的国家监管机构尽早沟通，以就非临床测试的要求和类型达成一致。

1.1 范围

根据本文档的目的，疫苗被认为是一类异质性的含有能够诱导针对传染病的特异性、主动和保护性宿主免疫的免疫原性物质的药品。

尽管大多数疫苗是为预防和暴露后预防而开发的，但在某些情况下，它们可能被用于治疗传染病的适应症，例如人类免疫缺陷病毒（HIV）和人乳头瘤病毒（HPV）。本文档考虑了预防和治疗传染病适应症的疫苗。

人用疫苗包括以下一种或多种：通过化学和/或物理方法灭活的微生物，保持适当的免疫原性；已选定其减毒而仍保留免疫原性的活微生物；从微生物中提取、由它们分泌或用重组DNA技术产生的抗原；嵌合微生物；在接种活载体或核酸后，在接种疫苗宿主体内产生的抗原，或通过体外化学合成产生的抗原。这些抗原可能处于其天然状态，也可能在引入突变后被截断或修饰，通过化学或物理方法解毒，并/或被聚集、聚合或与载体偶联以提高免疫原性。抗原可以单独呈现，也可以与佐剂一起呈现，或者与其他抗原、添加剂和其他赋形剂组合使用。

治疗非传染性疾病（例如某些癌症疫苗）的治疗性疫苗和用作免疫原的单克隆抗体（例如抗独特型抗体）在此不予考虑。

1.2 术语表

下面给出的定义适用于本指南中使用的术语。在其他上下文中，它们可能有不同的含义。

佐剂:旨在增强相关免疫应答及后续疫苗临床效果的物质。

加强免疫接种:在初次接种疫苗后的特定时间间隔进行的疫苗接种，以增强免疫应答并诱导长期保护。

联合疫苗:疫苗由两种或更多抗原组成，这些抗原可以由制造商组合，或者在给药前立即混合，旨在预防一种以上的疾病，或者预防由同一生物体的不同菌株或血清型引起的疾病。

转基因生物（GMO）:指基因材料以自然交配和/或自然重组不会发生的方式被改变的生物体或微生物。此定义涵盖包括病毒、类病毒以及动物来源的细胞培养在内的微生物，但不包括裸重组DNA或裸重组质粒。

良好临床实践（GCP）:临床研究的一个标准，涵盖了研究的设计、执行、监测、终止、审计、分析、报告和记录，并确保研究在科学和伦理上合理，且调查中的药品产品的临床特性（诊断性、治疗性或预防性）得到妥善记录。

良好实验室实践（GLP）:一个与组织流程及计划、执行、监测、记录、归档和报告非临床健康和环境安全研究的条件相关的质量体系。GLP原则可被视为一套标准，作为确保研究质量、可靠性和完整性、可验证结论的报告以及数据可追溯性的基础。

良好生产规范（GMP）:药品质量保证的一部分，确保产品始终按照适用于其预期用途的质量标准以及市场营销授权要求进行生产和控制。在这些指南中，GMP指的是世界卫生组织发布的现行GMP指南。

免疫原性:疫苗诱导抗体介导和/或细胞介导免疫和/或免疫记忆的能力。

疫苗的非临床评估:在疫苗的临床开发阶段之前和期间进行的所有体内和体外测试。疫苗的潜在毒性不仅应在开始人体试验前进行评估，而且在整个临床开发过程中都应进行评估。

质粒:能够在细菌细胞中复制的双链环状DNA分子。

效力:使用适当的定量生物测定法，基于与有关生物属性相关的产品属性来衡量生物活性。

疫苗的临床前评估:在疫苗首次进行人体测试之前进行的所有体内和体外测试。这是启动临床试验的先决条件，包括产品表征、概念验证/免疫原性研究和动物安全性测试。

临床前毒性研究:以展示候选疫苗产品的安全性和耐受性为主要目的的研究。临床前毒性研究的设计应满足研究设计部分所列的标准，以被认为支持预期的临床试验。

基础免疫接种:在预定的时间段内进行的第一次或一系列疫苗接种，各剂之间的时间间隔小于6个月，以诱导临床保护。

产品表征:对特定产品进行全面的一系列物理、化学和生物测试。这些测试包括但不限于过程中控制测试、外源因子检测、工艺添加剂和工艺中间体的检测以及批放行。

方案或研究计划:一份文件，其中阐述了非临床研究的背景、理由和目标，并描述了其设计、方法和组织，包括统计考虑因素，以及执行和管理的条件。

相关动物模型:接种疫苗后会产生与预期人类反应相似的免疫反应的动物。众所周知，不同物种间的免疫反应可能存在差异。理想情况下，所选动物物种应对所考虑的病原体或毒素敏感。

给药途径:候选疫苗产品引入宿主的手段。可能的给药途径包括静脉、肌内、皮下、经皮、真皮内、经皮、口服、鼻内、淋巴结内、阴道内和直肠内途径。

血清转化:预定义的抗体浓度增加，被认为与从血清阴性转变为血清阳性的过渡相关，提供有关疫苗免疫原性的信息。如果存在预先存在的抗体，血清转换被定义为从预定义的低水平到显著更高的预定水平的转变，例如几何平均抗体浓度增加四倍。

验证:根据良好生产规范的原则，证明任何程序、工艺、设备（包括所使用的计算机软件或硬件）、材料、活动或系统确实能够达到预期结果的行为。

2 候选疫苗的特性表征

2.1 疫苗生产

起始材料的生物特性、生产工艺以及用于表征产品批次的测试方法是在疫苗非临床测试的设计和解释中需要考虑的重要因素。许多疫苗是使用原核或真核微生物生产的，而这些微生物的微妙变化可能会从根本上影响疫苗产品。因此，建立种子批系统对疫苗生产至关重要。此外，这些产品的质量、安全性和效力通常对制造条件的变化敏感。疫苗制备的质量和安全不能仅通过成品测试来保证，而是依赖于遵循良好生产规范（GMP）原则的严格制造过程控制（7）。这包括展示起始材料（原材料和种子）的纯度和质量。 过程中控制测试、测试工艺添加剂和工艺中间体，以及开发和建立批次放行测试。此外，由于物理和化学特性与这些产品的免疫原性和效力之间的关系往往不完全清楚，因此应始终通过使用生物测定法对生物特征进行补充，以完善物理和化学产品表征。开发适当的实验室方法来表征疫苗配方，包括其成分、安全性及效力，是任何针对细菌、病毒或寄生虫的新疫苗或新型疫苗临床使用的先决条件。

生产一致性至关重要，证明产品与在临床研究中已证实安全、具有充分免疫原性和保护性的疫苗批次没有差异是疫苗评估、许可和批次放行的关键组成部分。因此，制造商应尽一切努力表征这些临床批次，并在可能的情况下保留部分批次供将来参考。

在没有合适的动物模型用于检测效力，或者没有直接的血清学或免疫学指标来反映临床保护作用时，挑战在于确保每个生产批次都具有与临床试验中显示具有保护作用的批次相同的保护效果。在这种情况下，越来越强调使用现代物理、化学和免疫学方法确保生产的一致性，这些方法能够以前所未有的精确度对产品进行表征。

用于临床前研究的疫苗批次应充分代表拟用于临床研究的配方，理想情况下，临床前测试应在与临床试验提议的相同批次上进行。如果这不可行，那么所研究的批次在物理化学数据、稳定性和配方方面应具有可比性。

至少，临床试验的候选疫苗应在良好生产规范（GMP）条件下制备，用于临床试验材料（8）。然而，在临床开发的后期阶段将需要全面的GMP（7, 9）。

在疫苗开发过程中对生产工艺提出的任何变更都应仔细考虑，以评估其对疫苗的质量、安全性和疗效的影响，以及是否需要额外的非临床和临床研究。

产品获得许可后，后续的生产方法或规模扩大将需要进行进一步的产品表征，以证明其与原批次的可比性，从而证明产品的安全性和疗效。所需的可比性测试程度取决于实施的变更性质（10）。这些变更应记录在案并咨询国家监管机构。监管机构应在法规中明确界定并实施规定，哪些变更仅需通知，哪些变更在实施前需要正式批准（11）。

现有许可的传统疫苗的特性和控制程序可能不适用于使用最先进技术开发的预防同一感染的新产品。例如，已针对无细胞百日咳疫苗的生产和控制制定了具体指南，这些指南与用于全细胞百日咳疫苗的指南不同（12）。同样，用于传统灭活霍乱疫苗的特性及控制的测试不一定适用于口服给药的新的灭活全细胞霍乱疫苗，需要开发一种适当的口服疫苗效力测试。

2.2 效力

效力测试测量疫苗的生物活性，但不一定反映其在人体中的保护机制。效力测量通常用于验证制造过程的一致性。疫苗效力测试的最初概念是为了量化疫苗的生物活性，并与已知生物活性的参考制剂进行比较，其中抗原成分尚未明确定义。

使用考虑中的疫苗免疫的动物进行的经典挑战研究已发展成为常规效力测定（例如，用于白喉和破伤风类毒素）。在全身性百日咳效力试验中，该试验包括对免疫和非免疫动物进行脑内挑战，已证实与人类的临床保护有关联（11）。在没有合适的动物挑战模型时，效力通常基于免疫反应的测量，通常是血清学反应（例如流感疫苗和乙型肝炎疫苗）。

最近，重组DNA方法和现代物理化学技术使得高度纯化的产品得以生产，这些产品的表征比传统生物制剂更好。然而，对于这些产品来说，可能仍然缺乏测量“相关”生物活性的能力。对于这些产品，可以使用物理化学参数（如抗原量、抗原大小、蛋白质含量等）进行表征，作为一致性的度量，但不一定是疫苗效力的度量。

对于活减毒疫苗，效力测定的方法通常不同。活病毒疫苗的效力通常基于细胞培养或鸡胚中最低感染剂量的滴定，这可以被认为是效力的替代标志，但不是效力本身的度量。对活减毒细菌疫苗（卡介苗BCG和伤寒疫苗（活Ty21A口服））的效力测定也采用类似的方法，其中存在的活体数量是效力的度量。

对于表达编码异源疫苗抗原插入物的疫苗（基于病毒或细菌载体的疫苗），仅通过测量菌落形成单位（CFU）或感染滴度来确定整个构建体的“生物活性”是不够的。对于这些疫苗，应考虑使用其他方法，如定量插入物的表达，或评估载体疫苗的有效剂量（ED50）。

2.3 稳定性

疫苗稳定性的评估是复杂的，因为它们非常容易受到环境因素失活的影响。效价，如术语表中所定义，应作为稳定性测试的一部分进行测量，除非基于生物活性的效价测试不可能进行。物理和化学产品的表征应包括在稳定性评估中。对于进入人体临床试验的产品，应收集足够的数据以支持产品在临床前和临床试验期间的稳定性。在某些情况下，可以使用加速稳定性数据来支持在正常储存温度下获得的初步数据。支持许可的稳定性数据应在拟定的储存条件下获得，并应基于长期的、实时稳定性研究。最后，还需要考虑标准和参考材料的稳定性，以确保用于测量相关参数的程序可靠地标准化。

2.4 国际和国家指南

世界卫生组织（WHO）通过相当多的国际磋商，制定了关于疫苗和其他重要生物制剂生产和控制的推荐和指南（13），这些成为确保产品全球可接受性的基础。这些文件规定了适当的起始材料需求，包括种子批次系统和细胞库；严格遵守既定协议；在生产过程中的特定步骤进行纯度、效力和安全性测试；以及妥善保存记录。与推荐相比，指南在涉及特定疫苗的具体问题上提供了更大的灵活性。

世卫组织还提供了关于参与疫苗生产的制造设施的指南。推荐可以在世卫组织关于生物制剂良好生产规范的文档中找到（7）。应特别注意制定生产过程和测试程序的书面标准操作程序。应在疫苗开发早期阶段尽早引入这些程序，并在进行第三阶段临床研究并提交上市许可申请时已经得到充分建立。疫苗生产和控制的基本原则发表在世卫组织技术报告系列中（7,14-18）。针对特定疫苗的世卫组织具体指南和建议也可获得，在适当情况下应予以参考。

世卫组织的建议和指南旨在具有科学性和咨询性质，并为国家监管机构和疫苗生产商提供指导。这些文件可能被各国卫生当局采纳为最终的国家法规或作为此类法规的基础。它们还用作决定诸如联合国儿童基金会（儿童基金）之类的联合国机构购买用于全球免疫计划的疫苗的可接受性的基础。疫苗和其他生物制品的监管要求也由其他机构制定，如欧洲药品管理局（欧洲EMA）和美国生物制品评估与研究中心（美国CBER）（19）；这些文件可在相应的网站（www.emea.eu.int和www.fda.gov/cber）上找到。此外，药典要求，如欧洲药典的要求，也为疫苗制定，可在www.pheur.org获取。

对于新开发的产品，可能没有特定的世卫组织、国家或药典要求，国家监管机构在评估产品以进行临床试验和获得许可的过程中，需要逐案与生产商就规格达成一致。对于其中一些新型产品，世卫组织在相关文件中提供了关于生产和控制的一般指导，例如描述DNA和肽疫苗的文件（14, 16），以及关于用于生产生物制品的动物细胞基质使用的建议（14）。

此外，关于如何保证生物制剂质量的一般信息以及批准生产和设立国家监管实验室的程序，可以在世卫组织相关指南中找到（17，18）。对于旨在全球市场销售的疫苗，其开发还涉及大量国际合作，确保对新型产品如预防HIV的疫苗的监管方法一致性至关重要（19）。

2.5 批签发和独立实验室评估

生物制剂生产方法的潜在变异性促使国家和国际层面建立了要求，以确定确保疫苗质量的程序，并评估制造商之间以及较长时间段内的一致性。获得许可的疫苗在投放市场前，需通过国家监管机构或国家监管实验室进行独立批签发（审查、检测和授权一批疫苗的批签发，该过程独立于制造商）。独立评估至少包括对制造商批签发数据的评估（方案审查），但在许多情况下，它还包括除了制造商进行的测试之外的独立实验室测试。

批签发或批次释放测试是在全面产品表征过程中选定的测试，用以证明产品的纯度、安全性和效力。批次释放测试提供了一种确保某一批次可一致生产的度量。验证和制定批签发测试和规范是贯穿于产品开发的整个过程，应在获得许可前完成。在一些国家，作为临床试验审批流程的一部分，国家监管机构要求提供疫苗样品。鼓励疫苗开发者在疫苗开发初期就咨询相关监管机构。

2.6 标准和参考材料

标准和参考材料在许可和质量控制过程中起着至关重要的作用，其作用范围从用于特定抗原识别测试到疫苗毒性、免疫原性和效价的测定。评估疫苗的方法标准化，以及评估对疫苗抗原的免疫反应的方法标准化同样至关重要，以便实验室之间、国家内部及跨国间，以及不同临床试验之间的结果可以直接进行比较。

世界卫生组织国际生物标准品和参考试剂是全世界使用的主要标准。此外，国家监管机构和制造商可能会建立次级（区域、国家）工作标准，以进行逐批次的疫苗质量检测。这些标准应当参照国际标准进行校准，如果存在的话。人们担心不同的次级标准可能导致与国际标准的“偏离”。大规模生产次级标准（例如……）（在区域基础上）减少了正在使用的次要标准数量，并应提高疫苗质量检测的准确性。例如，欧洲委员会欧洲药品质量部门积极参与制定针对世卫组织国际标准校准的疫苗的工作标准。世卫组织国际标准和参考试剂的完整清单可在世卫组织网站www.who.int/biologicals上找到。

3 免疫原性及其他药效动力学研究

疫苗产品的药效动力学研究通常旨在评估其免疫原性。然而，药效动力学研究也可能扩展至包括佐剂的药理学。

应在动物模型中进行免疫接种研究，因为它们可能提供有价值的“概念验证”信息以支持临床开发计划。此外，来自适当动物模型的免疫原性数据有助于建立产品的免疫学特性，并可指导选择将在临床试验中评估的剂量、时间表和给药途径。非临床免疫原性研究应评估接种疫苗的动物体内诱导的相关免疫反应，例如体液和/或细胞介导的免疫反应。根据诱导的免疫反应，此类研究可能包括评估疫苗接种动物的血清转化率、几何平均抗体滴度或细胞介导免疫。非临床研究应尽可能设计用于评估相关的免疫反应，包括导致保护的功能性免疫反应（例如中和抗体、调理吞噬活性等）。这些研究也可能旨在解决抗原和/或活病毒之间的干扰。如果疫苗包含不止一种确定的抗原（例如由3-5种蛋白质产品组成的无细胞百日咳疫苗），则应对每种抗原的反应进行评估。在适当的情况下，可进行相应的感染性挑战/保护研究以确认动物模型的相关性。在解释此类研究获得的数据时，主要关注点应是确定动物模型与人类疾病和免疫反应的相似程度。应当认识到，动物模型常常无法预测人体中的免疫原性和效力。

4 毒性评估

疫苗的非临床安全性评估需要在疫苗发展不断变化的背景下进行考量。因此，基于可获得的最佳科学证据的判断应始终是对是否需要非临床安全性研究、研究类型和研究设计的任何决策的基础。同样，对临床前研究数据的解释也应运用科学判断，考虑风险与收益比、动物模型、剂量等因素。例如，在动物模型中观察到超敏反应并不一定排除进行临床试验的可能性，但可能表明需要仔细监测某个特定的临床参数。

第4.1节提供了一个设计疫苗临床前毒性研究的一般框架。本节所列参数被认为是进行人体临床试验前安全评估的最小必要条件，在认为需要进行临床前安全性研究的情况下。由于任何毒性研究的设计都是针对特定产品的，并且基于适应症，因此可能需要根据特定产品特征、可用动物模型、方法学等因素对下面概述的框架进行修改。

第4.2节提供了执行可能需要逐案进行的特殊毒性评估的额外考虑因素。

4.1 基本毒性评估

4.1.1 研究设计

临床前毒性研究应足以识别和表征疫苗潜在的毒性效应，以便研究人员能够得出结论，认为继续开展临床研究是合理的。在设计动物毒理学研究时应考虑的相关参数包括相关动物种类和品系、疫苗接种计划和给药方法，以及终点评估的时间（例如临床化学采样、抗体评估和尸检）。给药途径应与临床试验计划使用的途径一致。当疫苗在人类临床试验中使用特定设备接种时，只要可行，动物研究中应使用相同的设备（例如，在猴子模型中使用麻疹气溶胶疫苗）。产品的潜在毒性效应应根据目标器官、剂量、暴露途径、暴露持续时间和频率以及潜在的可逆性进行评估。疫苗配方的毒性评估可以在专门的独立毒性研究中进行，也可以与安全性和活性研究结合进行，后者在设计中已纳入毒性终点。研究还应包括对局部耐受性的评估。

4.1.2 动物种类、性别、年龄和组的大小

用于毒性测试的动物数据应包括有关来源、种类和动物饲养程序（例如，动物饲养、喂食、处理和护理）的信息。通常建议使用外来动物。需要根据可接受的兽医医疗实践评估动物的健康状况，以确保动物没有任何可能干扰研究的状况。例如，可能需要对实验室动物进行单独饲养，以最小化交叉感染的风险。

只要可能，应在对疫苗生物效应敏感的物种中对产品的安全性特征进行表征。理想情况下，所选物种应对病原体或毒素敏感。使用的动物物种应对疫苗抗原产生免疫反应。通常，一种相关动物物种就足以用于毒性研究，以支持临床试验的启动。然而，在有些情况下可能需要两种或更多种动物来表征产品，例如当疫苗诱导的保护机制尚不清楚时（例如，鼻喷流感疫苗和鼻喷麻疹疫苗）。

此外，当观察到产品的药代动力学存在种特异或株特异差异时，可能需要在不止一项安全性研究和不止一个动物模型中解决产品的非临床安全性问题。

治疗组的大小取决于所选用的动物模型。使用非人灵长类动物的研究中使用的动物数量预计会少于使用啮齿类动物的研究。对于小动物模型，例如大鼠和小鼠，建议每组研究大约10只雄性和10只雌性。

通常，啮齿类动物研究的开始年龄约为6-8周，兔子则为3-4个月。

4.1.3 剂量、给药途径和对照组

毒性研究应使用能最大化动物对候选疫苗及其诱导的免疫反应（例如，抗体峰响应）的剂量进行。通常，作为基本毒性评估的一部分，不需要评估剂量-反应关系，且不必确定致死剂量。然而，可以进行剂量反应性试验以确定哪种剂量能在动物模型中诱导出最高水平的抗体产生。如果可行，应在动物模型中评估拟议临床试验中将使用的最高剂量（以绝对数值表示）。然而，剂量有时受到单次注射可给予的总体积的限制，并且应遵循动物福利指导原则。在这种情况下，总体积可以通过同一给药途径在多于一个部位进行给予。或者，可以使用超过基于mg/kg的人用剂量且在动物模型中能诱导免疫反应的剂量。在这种情况下，人和动物剂量的比例因素应当得到证明。

给予试验动物的剂量数量应等于或大于拟议用于人类的剂量数量。为了更好地模拟拟议的临床应用，疫苗剂量应在预定的时间间隔内给予，而不是作为每日剂量；毒性研究中使用的剂量间隔可能比人类临床试验拟议的间隔短（例如2-3周），非临床试验中的剂量间隔可能基于在动物模型中观察到的一级和二级抗体反应的动力学。在预期疫苗诱导的抗体将中和活病毒载体的情况下，可能会进行单剂量研究，从而限制感兴趣基因的表达（例如抗腺病毒的免疫反应），或者在动物中诱导的免疫反应

预计动物会对疫苗配方中存在的物种特异性蛋白质（例如作为佐剂的重组人细胞因子）产生反应。给药途径应与人类临床试验中预期的使用途径相对应。如果在安全性研究中使用特定给药途径（例如鼻内给药）观察到毒性效应，则使用不同给药途径（例如静脉注射）的进一步毒性研究可能有助于了解该产品的全部毒性谱。

研究设计应包括一个或多个阴性对照组，以评估治疗的基线水平。如有必要，研究中还可以包括活性对照组（例如不含抗原的疫苗配方）。研究应包括在治疗后较晚时间点处处死并评估的动物额外治疗组，以调查在治疗期间观察到的任何不良效应的可逆性，并筛选可能的延迟不良效应。

4.1.4 监测参数

毒性研究应探讨产品引起局部炎症反应的可能性，以及对引流淋巴结、全身毒性和免疫系统的潜在影响。毒性研究应获得广泛的信息。应监测的参数包括每日临床观察、每周体重和每周食物消耗。在给药的第一周内，建议频繁测量体重和食物消耗（如果可行），因为这些是敏感的参数，表明“疾病”。应在首次和最后一次给药后大约1-3天以及恢复期结束时考虑进行血液学和血清化学的中期分析。血液学和血清化学分析至少应包括评估相对和绝对差异白细胞计数（淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、异常细胞）和白蛋白/球蛋白比率、酶和电解质。在某些情况下，评估凝血参数、尿液样本和血清免疫球蛋白类别也可能有用。数据不仅应在治疗期间收集，还应在恢复期后（例如，最后一次给药后2周或更长时间）收集，以确定持续情况，并观察潜在不良反应的加剧和/或可逆性。

在研究终止时，应测量最终体重（经过一段禁食时间）。应采集终端血样，并按照前一段所述进行血清化学、血液学和免疫学调查。应评估候选疫苗诱导的免疫反应，以确认已选择了相关动物模型。应进行全面的大体尸检，收集并保存组织，检查大体病变，记录器官重量（23）。组织病理学检查应进行，并特别注意免疫器官，即淋巴结（包括局部和远离给药部位的）、胸腺、脾脏、骨髓以及派伊尔斑或支气管相关淋巴组织，还有可能因选择的特定给药途径而预期受影响的器官。病理学检查应始终包括关键器官（例如大脑、肾脏、肝脏和生殖器官）以及疫苗接种部位。待检组织的选择（从仅限于免疫和关键器官的简短列表到附录中提供的完整列表）将取决于所讨论的疫苗，以及从疫苗组分的先前非临床和临床测试中获得的知识与经验。例如，对于没有先前非临床和临床数据的新型疫苗，则需要进行完整的组织检查。因此，待测组织的列表应根据具体情况逐案确定，并征询相关监管机构的意见。数据应按原始采集值的完整列表报告，并进行总结。

4.1.5 局部耐受性

局部耐受性的评估应作为重复剂量毒性研究的一部分进行，或者作为独立的研究进行。耐受性应在因给药方法而与疫苗抗原接触的部位确定，同时也在意外暴露的部位（例如）确定。在通过气雾剂给药期间的眼睛暴露）到疫苗。更多细节已在其他地方发表（24）。如果在第4.1节中概述的基本毒性研究中观察到异常，可能需要进一步研究以评估毒性效应的机制。

4.2 额外的毒性评估

4.2.1 特殊免疫学调查

在某些情况下，来自非临床和临床研究或自然疾病数据的免疫反应评估结果可能表明毒性的免疫学方面，例如免疫复合物的沉淀、由于分子模拟或疾病加剧（例如，灭活麻疹疫苗）导致的对宿主自身抗原决定簇的体液或细胞介导免疫反应。在这种情况下，可能需要额外的研究来探究观察到的效应机制。

疫苗决定簇与宿主分子的高度相似性可能导致由分子模拟引起的自身免疫反应（26）。因此，即使公认分子模拟不一定会导致自身免疫，任何其特性可能与宿主抗原相似的疫苗抗原都应谨慎对待。

由于在选择和发展相关动物模型以解决上述问题时可能需要相当大的努力，因此在开发与自身免疫病理相关的疾病疫苗时应当小心谨慎，并提供充分的理由。

如果数据表明疫苗所针对的病原体可能会引起自身免疫病理，那么在有合适的动物模型的情况下，可能需要通过个案研究来解决这一担忧。

应当注意，观察到自身免疫反应的生物标志物并不一定与病理性后果相关联。例如，自身免疫抗体的存在并不一定意味着自身免疫病的诱导（25）。

当抗原、佐剂、辅料或防腐剂引起的超敏反应成为关注点时，可能需要额外的调查。

4.2.2 发育毒性研究

通常不需要对用于儿童免疫接种的疫苗进行发育毒性研究。然而，如果疫苗的目标人群包括孕妇和具有生育能力的女性，则应考虑进行发育毒性研究，除非制造商提出科学上合理且临床上有根据的论点，证明进行此类研究是不必要的。对于预防性疫苗，生殖毒性评估通常仅限于产前和产后发育研究，因为主要关注的是对发育中胚胎、胎儿或新生儿的潜在不良效应。应根据具体情况考虑是否需要进行生育力和断奶后评估。所选用的动物模型应对疫苗产生免疫反应，这通常是通过血清抗体测量来确定的。此外，通过测量脐带或胎儿血液中的疫苗诱导抗体来评估母体抗体转移是重要的，以验证胚胎或胎儿是否暴露于母体抗体。给药途径应模拟临床给药途径。理想情况下，最大人体剂量应用于试验动物。如果无法给予完整的人体剂量，例如对可给予的总体积有限制，或者观察到可能导致母体应激的局部毒性，则应使用超过人体剂量（按毫克/公斤计算）且能在动物中诱导免疫反应的剂量。

为了评估疫苗在器官发生期间可能产生的任何潜在不良反应，通常在植入至硬腭闭合和妊娠结束（根据ICH S5a文件定义为C、D和E阶段）期间给孕动物接种疫苗。由于大多数使用的动物模型的妊娠期相对较短，通常需要在交配前进行治疗以确保胚胎或胎儿最大程度地暴露于疫苗诱导的免疫反应。对于预防性疫苗，施用的剂量数量取决于反应的开始时间和持续时间。在妊娠期的某些时候可能需要加强接种，以维持整个妊娠期的高抗体水平，并使发育中的胚胎暴露于疫苗配方的成分。终点包括但不限于存活率、吸收、流产、胎儿体重和形态学。建议读者参考其他出版物，以了解用于评估产品对胚胎或胎儿发育潜在毒性效应的终点的指导（27）。还建议在研究设计中加入从出生到断奶期间对幼崽的产后随访期，以评估生长、体重增加、吸吮活动和存活率的正常性。因此，研究设计应将测试组分为子组。一半的动物应通过剖宫产分娩，另一半则允许自然分娩幼崽，不进行手术干预。

4.2.3 遗传毒性和致癌性研究

通常不需要对最终疫苗配方进行遗传毒性研究。然而，对于特定疫苗成分，如新型佐剂和添加剂，可能需要此类研究。如有需要，应在首次人体接触前进行体外突变和染色体损伤测试。遗传毒性的全套测试可以与临床试验并行进行（28）。

疫苗抗原不需要进行致癌性研究。然而，对于特定疫苗成分，如新型佐剂和添加剂，可能需要此类研究。

4.2.4 安全药理学

安全药理学的目的是研究候选疫苗对生命功能的影响。如果来自非临床和/或人体临床研究的数据表明疫苗（例如）基于特定类毒素的）可能会影响生理功能（例如中枢神经系统、呼吸系统、心血管和肾功能），而不仅仅是免疫系统的功能。安全药理学研究应纳入毒性评估中。有关此主题的有用信息可以在《人用药物安全药理学研究指导原则注释》（29）中找到。

4.2.6 药代动力学研究

通常不需要进行药代动力学研究（例如，用于确定疫苗组分的血清或组织浓度）。应根据具体情况考虑是否需要特定研究（例如，在使用新型佐剂或替代给药途径时），并可能包括局部沉积研究，以评估疫苗组分在注射部位的保留及其进一步分布（例如，至引流淋巴结）。在新制剂、新型佐剂的情况下，或当打算使用替代给药途径（例如，口服或鼻内给药）时，应考虑进行分布研究。

5 特殊考虑

5.1 佐剂

佐剂可包含在疫苗配方中或与疫苗共同给予，以增强对特定抗原的免疫反应，或针对特定的免疫反应。重要的是，所使用的佐剂符合药典要求（如果存在的话），并且不会引起不可接受的毒性。

佐剂活性是多种因素的结果，一种特定抗原/佐剂配方获得的免疫反应通常不能外推到另一种抗原。各个抗原在物理和生物特性上存在差异，抗原与佐剂的相互作用也可能不同。必须根据所需的免疫反应类型选择佐剂，并且必须将佐剂与抗原一起配制，以优化两者的分布，确保它们能够到达相关的淋巴组织。疫苗的给药途径也是影响佐剂效力和安全性的重要因素。

佐剂的效果应在临床前免疫原性研究中展示。如果新佐剂没有毒理学数据，应首先单独进行佐剂的毒性研究。一般来说，应根据新化学实体的要求对新或新型佐剂进行评估（30-32）。这些数据可由疫苗生产商或佐剂生产商获得。除了评估佐剂本身的安全性外，评估抗原和佐剂组合是否在动物模型中产生协同不良反应也很重要（33, 34）。当使用物种特异性蛋白质（例如细胞因子）作为新型佐剂时，应考虑物种特异性反应的问题。

在评估佐剂和疫苗组合的安全概况时，应使用拟议用于临床使用的配方。

应考虑佐剂（例如）的相容性……应对疫苗中所有抗原组分的免疫干扰缺乏进行评估。如果适用，应证明疫苗中所有抗原组分的吸附在批次间是一致的。作为稳定性研究的一部分，应在产品有效期内进行抗原的潜在脱附，并报告结果和设定规范，因为这不仅可能影响产品的免疫原性，还可能影响其毒性特征。

应当注意，没有单独获得许可的佐剂，它只作为特定疫苗的成分。

5.2 添加物（辅料和防腐剂）

当使用一种新的添加物且没有毒理学数据时，应首先单独进行该添加物的毒性研究，并根据新化学实体指导原则（31）记录结果。应与第4节所述的动物模型中考虑的最终疫苗配方的毒性特征一起记录新添加物与所有疫苗抗原的相容性。

5.3 疫苗配方及给药装置

疫苗配方（即液体形式、胶囊或粉末）以及给药装置可能会影响疫苗的吸收、有效性及安全性。理想情况下，动物安全性研究中测试的给药装置和疫苗配方应与临床计划使用的完全相同。然而，可能无法获得可用于测试临床用给药装置的动物模型。在这些情况下，为了开发合适的动物模型，可能需要进行初步研究以确定和优化该动物模型中药物输送的条件，然后才能用它来评估产品的临床前安全性。

5.4 替代给药途径

当使用通过替代途径（例如鼻内、口服、皮内、直肠和阴道途径）给药的疫苗配方时，可以假设其效力、相关免疫原性、耐受性、毒性和长期安全性可能与通过非肠道途径给药的产品不同。因此，当提出不同的给药途径时，可能需要使用单独的疫苗配方和/或佐剂在适当的动物模型中进行非临床安全性研究，以解决与这些途径接种疫苗相关的特定安全问题。下面讨论了使用替代途径接种疫苗可能需要考虑的特定问题。

5.4.1 动物模型

对于通过替代途径接种的疫苗，应特别考虑所选动物模型的疫苗接种部位的解剖学和生理学以及其接受疫苗给药的可及性。例如，对于鼻内接种的产品，理想情况下选择的物种应对产品喷雾给药有反应。通常，兔子和狗是使用喷雾装置的测试模型；然而，它们的嗅球受到高度保护，需要特殊技术以确保测试产品达到该器官。尽管小鼠和大鼠是有效的模型，但对这些物种进行鼻内给药存在技术困难。如果非人灵长类动物对所述感染因子敏感，可能更倾向于对其进行鼻内给药。

根据对特定给药途径的关注程度，或者在动物模型对候选疫苗的敏感性方面存在种属特异性差异时，可能需要通过不止一项安全性研究和不止一种动物模型来解决产品的临床前安全性问题。

5.4.2 剂量

由于从使用胃肠外途径给药的研究中得出的最佳剂量可能与用于其他给药途径的剂量不同，因此可能需要针对特定给药途径进行剂量探索研究。同时，应考虑接种的疫苗总体积，因为它可能影响安全性研究的结局。例如，给小鼠每鼻孔超过5微升的鼻内试验制剂会导致试验制剂被吞咽，而不是被鼻粘膜吸收。

5.4.3 终点

毒性终点将包括第4节中描述的那些，并可能包括额外的结局指标，这些指标将取决于给药途径以及与特定给药途径和靶器官相关的具体问题。例如，如果担心鼻内给药后疫苗成分可能进入大脑，那么可能需要进行免疫组化和“原位”方法以及/或神经学检测和检查。对于通过吸入给药的疫苗，结局指标可能包括肺功能测试和肺部组织病理学数据。可能需要付出相当的努力来开发适当的方法来解决与新给药途径使用相关的潜在安全问题。

5.4.4 免疫原性评估

开发适当的测定法以测量黏膜免疫反应对于预期作为黏膜免疫原发挥作用的疫苗至关重要，因为单独的血清学检测可能无法反映黏膜疫苗的相关免疫反应。因此，除了测量血清学反应外，可能还需要评估T细胞反应、抗体分泌细胞和细胞因子产生。此外，可能需要开发测定法来评估在远离疫苗抗原接种部位诱导的局部和全身反应。

6 针对特定类型疫苗的特殊考虑

除了第3、4和5节中概述的测试策略外，可能需要进行研究以解决与特定产品类型相关的特定安全问题，使用适当的体外和体内测试方法。活疫苗和联合疫苗的具体测试要求将在下文中讨论。关于其他类型疫苗的生产和控制的详细信息可在世界卫生组织（WHO）的生产和质量控制指导文件中查阅（13），并应予以咨询。例如，在最近针对DNA疫苗（16）、合成肽疫苗（18,35）以及Hib结合疫苗（26）等特定疫苗制定的指导原则中，讨论了与非临床测试相关的问题，并在制定该疫苗的非临床研究适当设计时应予以考虑。

6.1 活疫苗

评估减毒程度和减毒表型的稳定性是活疫苗非临床测试计划的重要考虑因素。实验室减毒标志物对此目的极为重要。这些标志物应能够区分活疫苗和完全有毒力的野生型菌株，并且理想情况下能够检测到部分恢复至完全毒力。为了评估减毒表型的稳定性，疫苗可以在超过生产用途的最大传代次数下的生产条件下进行传代。减毒的稳定性还可以通过在疫苗生产条件之外的条件下来评估。例如，较高或较低的温度可能会对回复到致病力施加选择压力。随后可以使用减毒的标记来鉴定新的疫苗种子制剂，并监测生产条件中任何显著变化对减毒表型的影响。

6.2 联合疫苗

通过配方或在重组抗原或血清型时产生的新组合应在动物模型中研究适当的免疫原性（如有），然后再启动人体临床试验（36, 37）。联合抗原应通过适当的物理化学方法进行检查，以评估组合后抗原性质的可能变化，如吸附到铝佐剂的程度，以及组合的稳定性。

应评估疫苗中每种抗原的免疫应答，包括应答的质量以及联合抗原之间可能存在的干扰和不兼容。与单独的抗原相比，在动物中研究新的组合以确定是否发生应答增强或减弱是更可取的。

应根据具体情况考虑是否需要使用动物模型评估新组合的安全性。如果担心结合抗原和/或佐剂可能会导致毒性问题（例如新型佐剂），则很可能需要进行此类评估。

对于从已获许可的组合疫苗开发出的新型候选单组分疫苗的情况，也将适用类似的非临床测试考虑。单价口服脊髓灰质炎疫苗与三价口服脊髓灰质炎疫苗的对比。

作者

这些关于疫苗临床前评估指南的初稿是由世界卫生组织起草小组成员在荷兰国家公共卫生与环境研究所（RIVM）于2002年3月14日至15日举行的会议后准备的，参会的有：

美国马里兰州罗克维尔市食品药品监督管理局生物制品评估与研究中心的疫苗及相关产品申请部门科学评审员M. Gruber博士；巴西里约热内卢Oswaldo Cruz基金会Bio-Manguinhos的A. Homma博士；荷兰国家公共卫生与环境研究所国际合作的J.G. Kreeftenberg博士；荷兰国家公共卫生与环境研究所的J.W. van der Laan博士；瑞士日内瓦世界卫生组织生物制品质量保证与安全协调员E. Griffiths博士；瑞士日内瓦世界卫生组织生物制品质量保证与安全的I. Knezevic博士。

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