Am80 脂质纳米颗粒在肠外接种灭活脊髓灰质炎疫苗后可作为肠道黏膜佐剂。

介绍

肠道病原体，例如霍乱弧菌 、 伤寒沙门氏菌 、产肠毒素大肠杆菌 （ ETEC）、轮状病毒和脊髓灰质炎病毒，是全球胃肠道感染的主要病原体，对全球发病率和死亡率造成了显著影响（ 1-4 ）。仅霍乱每年就影响约 130 万至 400 万人，造成 2.8 万至 14.3 万人死亡（ 5 ）；伤寒每年导致超过 900 万例病例和 11 万例死亡（ 6 ）；而 ETEC 每年导致多达 2.8 亿例病例和超过 5 万例死亡（ 7 , 8 ）。针对这些病原体的有效疫苗接种策略需要诱导胃肠道黏膜免疫，因为这些感染通常起源于此（ 8 , 9 ）。然而，在胃肠道中获得强效的黏膜免疫反应极具挑战性，尤其是灭活疫苗或亚单位疫苗，它们缺乏减毒活疫苗模拟自然感染过程诱导肠道黏膜免疫的能力（ 10 , 11 ）。一些佐剂（添加到疫苗中以增强免疫反应的物质）在诱导胃肠道免疫方面显示出一定的潜力，但也带来了相当大的挑战（ 12 ）。 例如，霍乱毒素（ 13 ）和热不稳定肠毒素（LT）（ 14 ）与毒性有关，而其他物质，如粘膜粘附聚合物纳米颗粒（NP）（ 15，16 ）（例如壳聚糖）或 CpG 寡脱氧核苷酸（ 17 ）和鞭毛蛋白（ 18，19 ） ， 通常需要特定的给药途径 ， 如口服、鼻腔或肺部给药，这限制了它们在肠外疫苗中的应用。

这一局限性在脊髓灰质炎疫苗接种方面尤为突出。目前，有两种脊髓灰质炎疫苗可供使用：口服减毒活疫苗（OPV）和注射灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）（ 20 ）。虽然 OPV 经济有效且易于接种，但它也存在显著风险，包括疫苗相关性麻痹性脊髓灰质炎以及可能发生神经毒性脊髓灰质炎病毒的逆转，后者可能导致病毒株的传播性和毒力与野生脊髓灰质炎病毒相似（ 20 ）。此外，在一名接种过疫苗的免疫缺陷个体中观察到脊髓灰质炎病毒复制长达 28 年，这凸显了免疫功能受损如何导致病毒即使在接种过疫苗的宿主体内也能长期排出和进化（ 21 ）。因此，持续使用 OPV 仍然是实现彻底根除脊髓灰质炎的一大挑战。虽然灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）克服了口服脊髓灰质炎疫苗（OPV）的主要缺陷，并能产生免疫球蛋白 G（IgG）抗体以防止脊髓灰质炎病毒在体内扩散（全身免疫），但它无法在肠道组织（脊髓灰质炎病毒的主要感染部位）诱导黏膜 IgA 反应（ 20 , 22 , 23 ）。这种黏膜免疫的缺乏使得接种疫苗者的肠道黏膜易受感染，从而导致病毒传播，并成为根除脊髓灰质炎工作中的一个关键缺口（ 24 ）。自 1988 年全球根除脊髓灰质炎行动启动以来，1 型野生脊髓灰质炎病毒（WPV1）在阿富汗和巴基斯坦仍然流行，2023 年报告了 12 例 WPV1 病例。 此外，循环疫苗衍生脊髓灰质炎病毒（cVDPV）仍然构成重大挑战，2023 年在 32 个国家造成 524 例病例（ 25 ）。 所以，建立疫苗接种策略至关重要，该策略应将 IPV 的安全性和全身免疫原性与 OPV 提供的粘膜免疫相结合。

既往研究表明，重复注射全反式维甲酸（atRA）可通过诱导小肠印迹促进肠黏膜免疫。小肠印迹是指 T 细胞和 B 细胞被编程以获得肠道归巢特性，从而使其能够特异性地迁移至小肠并启动局部肠黏膜免疫应答（ 26 , 27 ）。在抗原暴露期间，atRA 已被证实可通过上调肠道归巢分子α4β7 和 CCR9 的表达，增强引流淋巴结（ LNs）中效应 T 细胞和 B 细胞归巢至小肠的能力，并促进类别转换以生成产生 IgA 的浆细胞（28-31） 。虽然以往基于维甲酸的黏膜佐剂研究已证实其具有黏膜印迹效应，但由于纳米颗粒结构复杂、多组分制备、需要冻干以及对释放动力学和包封率等关键参数的表征不足，其临床转化受到限制（ 32 , 33 ）。随着维甲酸治疗应用范围的扩大，人们开发了多种具有改进性能的合成类似物。例如，合成维甲酸 Am80 的效力约为全反式维甲酸（atRA）的 10 倍，毒性更低，化学稳定性更高（ 34 , 35 ），有望成为诱导黏膜免疫的更有效分子。 游离类视黄醇化合物的给药和递送面临诸多挑战，例如：(i) 注射部位的毒性和局部炎症或皮疹 ( 36 )，这限制了耐受性；(ii) 水溶性差 ( 37 )，需要高剂量或使用有机溶剂，如二甲基亚砜 (DMSO) 或乙醇，以及乳化剂，如 PEG400，这可能导致注射部位出现严重的组织毒性，增加不良反应的风险；(iii) 化学不稳定、半衰期短、生物利用度低 ( 38 – 40 )，导致快速降解和治疗效果降低，这限制了治疗潜力；(iv) 需要每天多次注射，这使得它们作为粘膜佐剂的临床转化变得复杂 ( 32 , 33 )。

为了应对这些挑战，我们开发了一种肠黏膜佐剂，即将小分子疏水剂 Am80 封装在纳米颗粒（NP）中。我们选择 NP 作为 Am80 的载体，是因为近期研究表明，粒径在 100 nm 范围内的 NP 可以有效地转运至淋巴结，并在那里启动更强的免疫反应（ 33 , 41 , 42 ）。为了选择最适合封装 Am80 的材料，我们首先评估了几种材料（表 S1）。粒径约为 100 nm 的 NP 表现出最佳的淋巴转运和淋巴结滞留性能（ 33 , 41 , 42 ）。因此，我们排除了粒径小于 100 nm 的载体（β-环糊精或 Pluronic F127），不再对其进行进一步评估。后续表征主要集中于流体动力学直径为 150 至 180 nm 的纳米颗粒[聚乳酸- 羟基乙酸共聚物 (PLGA)、PLGA-聚乙二醇 (PEG)、缩醛化葡聚糖和脂质纳米颗粒 (LNP)]。尽管多种纳米载体在体内均能产生可检测的反应，但只有 Am80-LNP 能诱导产生可重复、稳定且显著的抗原特异性 IgA，这与 Am80 在约 5 天内的持续释放相符，该释放时间窗口与小肠印迹所需的时间窗口相匹配。此外，只有 Am80-LNP 能在淋巴结中保留长达 72 小时。因此，我们对 Am80-LNP 进行了工程改造，以有效克服已发现的挑战。具体而言，通过将 Am80 封装在 LNP 中，我们最大限度地减少了游离化合物与注射部位的直接接触和积累，从而降低了毒性，并降低了局部炎症和组织刺激的风险。 包封技术还解决了水溶性差的问题，使得 Am80-LNPs 能够在磷酸盐缓冲液（PBS）中稳定悬浮，无需使用 DMSO 或乙醇等有毒有机溶剂即可轻松给药。此外，LNP 基质提供了一个保护环境，通过屏蔽分子免受快速降解，解决了游离 Am80 的化学不稳定性、半衰期短和生物利用度低的问题。经改造的 Am80-LNPs 能够使 Am80 在数天内持续释放，无需每日注射，从而提高了治疗效果。与持续释放相一致，我们利用离体 IVIS 成像技术证实，Cy5 标记的 Am80-LNPs 在引流淋巴结（dLNs）中可滞留长达 72 小时。我们证明，LNP 中 Am80 的持续释放可通过小肠印迹诱导肠道粘膜免疫。

为了测试我们 Am80-LNP 制剂的转化潜力，我们评估了其作为肠黏膜佐剂在接种 Sabin IPV（sIPV）2 型（IPV-2）的 Wistar 大鼠中的效力。我们还纳入了 Am80 包封的聚乙二醇化脂质包覆 PLGA 纳米颗粒（Am80-PLGA NPs）作为与 Am80-LNP 组的比较。与 Am80-LNP 不同，Am80-PLGA NPs 表现出突释特性，90%的 Am80 在一天内释放。这一比较进一步强调了 Am80 释放动力学在调节黏膜免疫反应中的关键作用。Am80-LNP 产生的 IPV-2 特异性粪便 IgA 水平比单独接种 IPV-2 高 20 倍，比游离 Am80 高 3 倍，比 Am80-PLGA NPs 高 4 倍。 Am80-LNPs 的疗效提升归因于其缓释动力学（5 天内释放 80%），而 Am80-PLGA NPs 则呈现突释特性（一天内释放 90%）。我们的结果进一步表明，仅将 Am80 包封于纳米颗粒中不足以诱导强效的黏膜免疫；合适的释放动力学至关重要，粪便 IgA 反应证实了这一点。中和抗体和 IgG 抗体滴度证实了显著的全身免疫，并与脊髓灰质炎的保护作用相关。小肠 IgA 染色显示 Am80-LNP 组的 IgA 水平是其他组的两倍，细胞因子分析显示，与其它组相比，Am80-LNP 组的干扰素-γ (IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-2 (IL-2)、IL-4、IL-6、IL-10 和 IL-17A 水平显著升高。此外，LNP 具有生物可降解性、生物相容性，并已获得美国食品药品监督管理局的批准，这进一步促进了 Am80-LNP 作为肠粘膜佐剂的使用（ 43 ）。 这些发现强调了 Am80-LNP 作为一种潜在的强效肠黏膜佐剂在肠外给药疫苗中的应用。