快速荧光灶抑制试验（RFFIT）的验证与评价 —— 作为狂犬病疫苗相对效价间接检测方法的中和抗体定量检测：NIH 试验的替代方案

Validation and evaluation of the rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) for the quantification of neutralizing antibodies as an indirect measure of rabies vaccine relative potency: An alternative to the NIH test.

摘要

狂犬病疫苗的质量控制对于确保其在预防每年导致约5.9万人死亡的致命疾病中的安全性和有效性至关重要。疫苗效力是反映疫苗引发保护性免疫反应能力的属性，必须符合国际标准：人用疫苗效价2.5IU/剂，兽用疫苗效价1.0IU/剂。传统上，狂犬病疫苗效力使用由法规强制规定的国立卫生研究院（NIH）测试进行评价，这是一种体内方法，但存在诸如高变异性、伦理问题、成本高昂以及程序耗时等局限性。快速荧光灶抑制试验（RFFIT）是一种半体外方法，用于定量血清中的狂犬病病毒中和抗体（RVNA）。这个RVNA滴度值可以在与参考疫苗校准后转换为效力值，提供了一种更高效的替代方法。与NIH测试相比，RFFIT变异性更低、处理时间更短，并且引发的伦理问题更少，同时保持准确性和可靠性。本研究验证了RFFIT用于RVNA检测，之后将用于间接测量狂犬病疫苗效力，遵循国际生物分析验证指南，并评估其特异性、准确性、精密度、线性、线性范围、定量限和稳定性。我们的结果显示RFFIT满足所有接受标准，表现出稳健性和可重复性。此外，在对14批商业兽用疫苗进行效力测试时，RFFIT与NIH测试的一致性达到92.85%，进一步证明了其作为NIH测试直接替代品的潜力。RFFIT能够提升疫苗质量控制，提供更高效和标准化的方法，意味着用于效力测试的动物数量将显著减少。

1.引言

狂犬病是一种影响哺乳动物的病毒人畜共患病，一旦出现神经症状，死亡率几乎达到100%，每年估计有5.9万人死于狂犬病。狂犬病病毒属于Lyssavirus属，在Rhabdoviridae科中，通过接触感染宿主咬伤或抓伤后的唾液传播。病毒传播后，会感染周围神经系统，然后扩散至中枢神经系统。

尽管该病严重，但由于其漫长的潜伏期，该疾病是可预防的。疫苗接种是治疗、预防和控制的主要策略，根据疫苗的不同，在接触前或接触后以三到四剂的日程安排进行接种。

由于这类生物制品在公共卫生领域具有至关重要的意义，因此必须采取严格的质量管控措施，以确保疫苗的安全性、有效性和效价。其中，效价指特定疫苗诱导免疫保护水平的能力，该水平需与产品获批时所证实的免疫保护水平相当，具体而言，即通过产生能中和病毒的抗体来实现这一保护效果。效价是关键质量属性（CriticalQualityAttribute,CQA）的一种，作为疫苗的核心特性，它是保障疫苗质量与安全的必要条件，同时对每一批疫苗的审批及商业化进程都起着决定性作用。

美国国立卫生研究院（NIH）研发了NIH测试，数十年来该测试一直用于评估狂犬病疫苗的效价。20世纪50年代，它被确立为美国狂犬病疫苗效价测试的标准方法。NIH测试是一种体内测试方法，其原理是给小鼠接种两剂疫苗，14天后用活狂犬病病毒对小鼠进行攻毒，以此评估疫苗的保护效果。然而，NIH测试在伦理和技术层面存在诸多问题：每批疫苗测试需使用大量动物（约184只小鼠）、耗时较长（≥28天）、成本高昂，且检测本身固有的变异性较大——此外，由于需使用活病毒，还会给动物带来痛苦。

鉴于NIH测试的上述缺陷，探索狂犬病疫苗相对效价的替代检测方法至关重要。一种颇具潜力的替代方案是检测狂犬病病毒中和抗体（RabiesVirus-NeutralizingAntibody,RVNA）滴度，该方法可用于评估兽用疫苗和人用疫苗的免疫状态及相对效价。其中，人用疫苗相对效价的评估方式为：将接种测试疫苗后产生的抗体滴度与接种参考疫苗后产生的抗体滴度进行比较。

快速荧光灶抑制试验（RapidFluorescentFocusInhibitionTest,RFFIT）是世界卫生组织（WHO）推荐的一种检测方法，其通过评估抗体阻止病毒进入细胞（进而预防感染）的能力来测定RVNA滴度。该方法可应用于疫苗审批和批次放行流程，且符合动物实验领域的“3R原则”（替代Replacement、减少Reduction、优化Refinement）。在RFFIT测试中，研究人员会给小鼠接种1/5剂量的测试疫苗。免疫14天后，收集小鼠血清，通过中和试验测定RVNA滴度——具体判定依据是细胞单层中是否出现荧光。

与NIH测试相比，通过RFFIT测定RVNA滴度具有明显优势：动物使用量减少（每批疫苗测试约需24只小鼠）、所需时间更短（>15天）、检测变异性更低，且动物所受痛苦更小（因无需接触活病毒）（见表1）。在这项研究中/通过RFFIT定量RVNA滴度得到了验证/并通过包括特异性、准确性、线性、精密度、线性范围、线性、定量限和稳定性在内的综合验证过程证实了它的有效性。最后/评估了几批兽用狂犬病疫苗/以比较通过RFFIT的RVNA滴度定量与传统NIH测试获得的相对效力结果。结果显示两种技术之间存在适当的一致性/支持实施经过验证的RFFIT法进行RVNA滴度定量作为NIH测试的替代方法。

表1快速荧光灶抑制试验（RFFIT）与NIH测试的对比

表2通过RFFIT进行狂犬病病毒中和抗体（RVNA）定量检测与NIH测试的分组情况

表3血清、绵羊狂犬病免疫球蛋白（SRIG）及病毒在不同条件下的稳定性评估，不同条件包括：4℃储存2周和4周、室温下放置15分钟或4小时，以及经过多次冻融循环。

3.结果

3.1.细胞传代优化

研究采用3组BHK-21细胞培养物对狂犬病病毒样本（CVS-7）进行评估，各组细胞的传代差异分别为20代、15代和10代（图2），所有细胞均来源于传代次数为67代的种子细胞。当使用传代差异为20代的一组细胞时，检测结果显示出显著差异（p<0.05）；而使用传代差异为10代和15代的两组细胞时，未观察到显著差异（p>0.05）。

这些结果表明，以本次实验所用的特定种子细胞（初始传代次数为67代）为起点，一支细胞冻存管复苏后的最大传代次数应控制在15代以内。设定这一限制的目的是避免因细胞传代次数不同而导致检测结果出现显著偏差。

3.2特异性

本研究以混合的VSA阳性血清作为狂犬病病毒中和抗体（RVNA）的异源抗体来源，对快速荧光灶抑制试验（RFFIT）的特异性进行评估。实验分析了5份来自接种测试疫苗（ST1-ST5）小鼠的RVNA阳性血清样本，以及1份来自接种参考疫苗（SR）小鼠的血清样本。每份样本均在两种条件下进行检测：一种是与混合的VSA阳性血清混合，另一种是与RVNA阴性且VSA阴性的血清混合（作为对照）。在所有情况下，与对照相比，变异系数均低于30%（图3、表S2）。对每份ST样本和SR样本进行的单因素方差分析（表S2）显示，添加VSA与未添加VSA的血清检测结果之间无显著差异（p>0.05）。这些结果符合特异性的可接受标准，表明样本中VSA的存在不会对该检测方法产生显著干扰。

3.3准确性、线性及线性范围

研究在6次独立检测中，对标准狂犬病免疫球蛋白（SRIG）的7个浓度（8、4、2、1、0.5、0.25和0.125IU/mL）进行了测试。总体而言，85.7%的批间检测样本回收率处于可接受范围（70%-130%，对应变异度低于30%）（图4A），因此符合预先设定的准确性可接受标准——该标准要求至少80%高于定量下限的数值需落在上述回收率范围内。此外，研究还通过评估更低浓度的样本以确定该检测方法的线性范围：在浓度为0.0625IU/mL和0.03125IU/mL时，回收率分别为146.37%和347.96%（数据未展示），这表明该方法在这些低浓度下无法满足准确性要求。因此，确定该方法的线性范围为8IU/mL至0.125IU/mL。

研究采用6次独立分析的结果评估线性，每位分析人员完成3次分析，且每份样本由两名分析人员分别进行单次检测。通过应用线性回归模型计算相关系数、截距、斜率及残差。图S1展示了线性回归模型的残差图；表S3汇总了两名分析人员实验所得的斜率及决定系数（R²）值；图4B则呈现了每位分析人员的线性回归线及95%置信区间。估算得出的R²值均处于可接受范围（≥0.95）。线性回归分析显示，分析人员1的斜率为0.996，分析人员2的斜率为1.233，两者均落在预先设定的可接受范围（0.80-1.25IU/mL）内，证实该模型符合可接受标准。

3.4精密度与空白限

精密度（包括重复性与中间精密度）的评估方式为：由不同分析人员在多次实验中对12份狂犬病病毒中和抗体（RVNA）阳性血清样本进行检测（图5A）。同一名分析人员检测每份样本的变异系数如图5B所示。结果显示，所有分析人员检测血清的变异系数均低于30%。此外，对每份血清样本（ST6-ST17）进行多次单因素方差分析（表S4），结果显示不同分析人员间的检测结果无显著差异（p>0.05）；析因方差分析结果同样表明无显著差异（表S5）。这些发现证实，快速荧光灶抑制试验（RFFIT）符合精密度可接受标准。

空白限（LOB=0.140IU/mL）的确定过程如下：采用4份不同的阴性血清样本（呈正态分布，图S2），通过以下结果验证该空白限——阴性样本检测结果均低于设定限值（数据未展示），且阳性样本的变异百分比低于30%。

3.5稳定性

血清、标准狂犬病免疫球蛋白（SRIG）及病毒的稳定性评估方法为：在将这些试剂用于RFFIT检测前，先使其处于多种储存条件下。具体处理方式包括：将血清和SRIG的分装样本在室温（RT）下孵育4小时、在4℃下储存2周和4周，以及经历1次或2次冻融循环后进行检测。评估血清时，对比的是抗体滴度（IU/mL）；评估SRIG时，假设所有分装样本的初始名义抗体滴度均为2IU/mL，对比的是半数有效剂量（ED50）值。所有检测结果均与对应的对照分装样本进行比较（图6、表S6），并采用Studentt检验确定统计学显著性（p<0.05；表S6、表S7）。结果显示，与对照相比，所测试的血清储存条件对RFFIT检测结果无显著影响；但在4℃下储存2周的SRIG分装样本，其检测结果与对照存在显著差异（p<0.05），这表明该条件可能对SRIG的稳定性产生影响。病毒稳定性的评估方式为：使用经历以下处理的病毒分装样本检测1份血清样本和SRIG——在室温下孵育15分钟、在4℃下储存2周和4周，或经历1次或2次冻融循环（表S6）。结果显示，在室温下孵育15分钟的病毒分装样本，以及经历1次或2次冻融循环的病毒分装样本，其检测结果与对照存在显著差异（p<0.05），表明这些条件会导致病毒稳定性下降。

3.6通过RFFIT测定狂犬病病毒中和抗体（RVNA）滴度与NIH测试所得效价结果的比较

研究对VECOLS.A.公司生产的14批兽用狂犬病疫苗，采用RFFIT法测定其RVNA滴度以确定相对效价，并将所得结果与参考疫苗的检测结果进行对比。同时，将获得的相对效价值与NIH测试结果（具体为检测效价是否大于或等于1IU/剂量，即≥1IU/剂量）进行评估（表4）。该阈值代表兽用狂犬病疫苗既定的效价标准，可确保每批疫苗均能引发足够的免疫保护作用，并满足商业化放行的最低标准。两种方法的一致性定义为：两种检测均得出≥1IU/剂量的结果。分析显示，所有批次的一致性达92.85%，这表明经验证的RFFIT方法与仍作为监管标准的NIH测试具有高度一致性。

4.讨论

开发并应用可靠、高效且符合伦理的狂犬病疫苗相对效价评估方法，对公共卫生和兽医卫生领域均至关重要。传统的美国国立卫生研究院（NIH）小鼠体内攻毒测试虽在历史上具有重要意义，但存在显著缺陷，包括生物变异性高、动物使用量大、与动物痛苦相关的伦理问题、成本高昂及流程耗时较长等。

本研究旨在依据国际生物分析验证标准，全面验证采用RFFIT法测定RVNA滴度的可行性——RFFIT是一种广泛应用的半体外方法，通过检测通常来源于免疫动物血清的中和作用（在细胞培养体系中进行），将其作为兽用狂犬病疫苗相对效价的适宜替代检测方法。研究结果表明，本研究中优化并应用的RFFIT法（通过测定RVNA滴度确定效价）符合严格的可接受标准，且与NIH测试结果高度一致，这证实该方法可作为常规质量控制的有效替代方案。

本次验证成功覆盖了大多数关键生物分析参数。特异性作为一项基本要求，通过使用抗水疱性口炎病毒（VesicularStomatitisVirus,VSV，原文“VSA”应为笔误，此处按病毒学通用命名修正）的异源抗体进行竞争实验得以证实。结果显示，该方法对狂犬病病毒中和抗体（RVNA）滴度的干扰极小，变异度远低于30%的可接受阈值；且与不含竞争抗体的对照组相比，无统计学显著差异（p>0.05）（图3、表S2）。这表明，即便样本中可能存在针对相关病毒的抗体，快速荧光灶抑制试验（RFFIT）仍能特异性检测狂犬病病毒中和抗体。

以世界卫生组织（WHO）国际标准品（标准狂犬病免疫球蛋白，SRIG）为参照进行测试时，该检测方法在0.125-8.0IU/mL的规定分析范围内，还展现出优异的准确性和线性。总体而言，85.7%的批间检测结果落在准确性±30%的可接受范围内（图4A）；线性回归分析显示，决定系数（R²）较高（R²≥0.99），斜率接近1（0.996-1.233），且完全处于0.80-1.25的可接受区间内（图4B、表S4）。已确定的空白限（LimitofBlank,LOB）为0.140U/mL，该值代表空白样本因背景噪声可能产生的最大信号值，据此可区分“分析物真实缺失”与“因分析物微量存在或分析噪声可能产生的检测结果”。

此外，RFFIT还展现出良好的精密度，这是其相较于NIH测试的一大关键优势。批内精密度（重复性）和中间精密度（实验室内部不同分析人员、不同日期检测的重现性）的变异系数（CV）均远低于30%的可接受限值（总变异系数分别为11.486%和14.371%）（图5、表S5）。方差分析（ANOVA）结果显示无显著差异（p>0.05），进一步证明了该方法的重现性。相较于完全体内实验的NIH测试常存在的高固有变异度，RFFIT的精密度水平有显著提升，这意味着该方法可为疫苗批次间的质量评估提供更稳定的结果。

结合本验证过程中获得的结果，所评估的各项参数与既往研究报道的参数具有可比性。在特异性方面，本研究观察到的变异值范围为0.10%-18.65%，这与Timiryasova等人（2019）报道的变异值范围（0%-22.8%）一致。在准确性方面，使用本研究中的标准狂犬病免疫球蛋白（SRIG）检测时，85.7%的数据变异度＜30%；而Timiryasova等人（2019）报道，其使用的两种SRIG分别有100%和83.3%的数据变异度处于相同范围，二者结果同样具有可比性。在linearity（线性）方面，两名分析人员得出的斜率分别为0.99和1.23，且决定系数（R²）均＞0.95；而Timiryasova等人（2019）报道的斜率为1.10和1.08，R²同样＞0.95，Kostense等人（2012）报道的斜率则为0.96和0.95。在精密度方面，批内精密度（重复性）和中间精密度的总变异系数（GCV）分别为11.49%和14.371%；其他研究则报道，批内精密度的变异系数（CV）范围为18%-26%，中间精密度的变异系数范围为26%-30%[23]，或总变异系数分别为15.7%和19.8%。此外，本研究还纳入了数据以分析NIH测试与RFFIT方法在测定相对效价时的一致性，而这一点在其他文献中并未涉及。

事实证明，对操作评估过程进行优化对于确保检测一致性至关重要。为该检测中所用的特定BHK-21细胞设定复苏后最多传15代的限制具有关键意义，因为当使用传代差异为20代的细胞时，病毒滴度测定结果出现了显著差异（p＜0.05）（图2）。这一结果凸显了控制细胞代次和传代次数的重要性，有助于降低细胞敏感性或生长情况的潜在变异——在维持可靠的细胞基检测方法中，这是一项标准操作。此外，在方法标准化过程中，还发现该检测对环境条件较为敏感，尤其是对二氧化碳（CO₂）浓度。本研究使用的MEM细胞培养基中含有碳酸氢盐缓冲体系，该体系负责调节生理pH值（通常为7.2-7.4）[28]，因此维持稳定的5%CO₂环境至关重要。CO₂浓度波动会导致pH值变化，进而影响细胞健康状态、代谢过程，并可能对病毒复制动力学或稳定性产生影响。这些发现强调，必须严格监测和控制培养箱参数，以确保RFFIT方法的重现性和可靠性，因为在细胞基检测中，环境变化可能是导致结果变异的重要因素。

对关键试剂的稳定性评估揭示了重要的操作注意事项。尽管试剂稳定性未被视为一项特定参数，也未正式纳入验证过程，但为这些试剂制定适宜的操作和储存条件，对于在常规应用中确保方法重现性和维持技术质量至关重要。血清中的狂犬病病毒中和抗体（RVNA）在典型短期条件下（包括多次冻融循环以及在4℃下储存长达4周）展现出可接受的稳定性（图6A、表S6）；然而，标准试剂（SRIG和病毒）却表现出特定的不稳定性。值得注意的是，SRIG在4℃下储存2周后出现显著不稳定（p＜0.05）（图6B、表S6），这表明在此温度下储存SRIG达该时长可能会影响检测准确性。此外，攻毒用病毒（CVS-7）被证明对室温暴露较为敏感：在室温下放置15分钟后，病毒滴度便出现显著下降（p＜0.05）（图6C、表S6）；且单次冻融循环会对后续SRIG的定量检测产生显著影响（p＜0.05）（图6C、表S6）。这些发现强调，必须严格遵循操作流程，尽量减少病毒原液在室温下的暴露时间和冻融循环次数；同时表明，与长期冷藏储存相比，使用新鲜制备或经验证的单次使用冻存分装SRIG可能是更优选择，这与其他稳定性研究的结果一致。

验证替代方法的一个关键环节是证明其与既定参考方法在目标应用场景（本研究中为疫苗批次放行决策）下的一致性。此前已有多项研究报道，用于狂犬病疫苗效价检测的血清学方法（检测RVNA）与NIH测试（检测直接保护作用）的结果具有高度一致性——这些研究为用血清学方法（本研究中为RFFIT）替代传统NIH测试提供了有力证据，且与本研究结论一致，即抗体检测结果可作为评估疫苗接种后保护效果的可靠指标。本研究中，以1IU/剂量为阈值，对14批商用兽用疫苗的效价分类进行比较，结果显示RFFIT与既往NIH测试结果的符合率高达92.85%（表4）。这种高度一致性证明，RFFIT适合在常规质量控制放行检测中替代NIH测试，可为疫苗效价提供具有可比性的保障。观察到的1例不一致结果，可能源于该特定批次疫苗效价处于临界值，也可能是既往NIH测试数据本身固有的变异性所致。此外，该一致性水平与其他比较基于RFFIT的方法和NIH测试的研究结果相符。最后，在遇到可疑结果时，NIH测试仍可偶尔作为辅助确认方法使用。

RFFIT方法的成功验证与应用具有显著优势，尤其从动物实验伦理“3R原则”（替代Replacement、减少Reduction、优化Refinement）的角度来看。尽管该效价检测流程仍包含初始体内步骤（给小鼠接种疫苗以使其血清中产生抗体），但RFFIT本身替代了NIH测试中极具痛苦的体内攻毒阶段。与完整的NIH方法相比，RFFIT大幅减少了每次检测所需的动物数量（例如，每批疫苗检测仅需24只小鼠，而NIH测试需184只）（表1），实现了“减少”原则；同时，它无需使用活病毒进行致命性脑内攻毒，显著减轻了动物的痛苦和应激，实现了“优化”原则。作为一种经验证的半体外功能性检测方法（通过细胞培养检测病毒中和作用），RFFIT代表着向完全替代体内测试中最严苛环节（攻毒阶段）迈出的重要一步，实现了“替代”原则的部分目标。除伦理优势外，RFFIT还具有实际应用优势，包括分析阶段耗时更短、潜在成本更低，且由于其包含基于细胞的体外检测环节并易于实施质量控制，因此标准化可能性更高。

越来越多的证据支持RFFIT方法的有效性，本研究为此增添了新的论据。RFFIT是一种广泛用于RVNA检测的技术，其应用不仅限于疫苗效价检测，还包括临床试验中免疫原性评估、病毒滴度测定、血清学监测[8,16]，且在诊断领域也具有潜在应用价值[35]。各项优化工作——如确定细胞传代限制、明确试剂稳定性特征、控制CO₂等环境因素，以及自动化技术或特定试剂的研发[8,35]——共同提升了这一重要检测方法在全球范围内的稳健性、可靠性和可及性。

需要说明的是，两种技术在疫苗效价检测结果上的比较虽具有附加价值，但并非本验证过程的组成部分。本研究针对RFFIT技术开展的验证，旨在确认其检测RVNA滴度的能力，而非直接验证其用于效价检测的性能。效价测定将是VECOLS.A.公司未来对该技术的应用方向，目标是将其用作商业化批次放行方法。尽管如此，整个研究仍作为实施前提交给监管机构以获取批准的材料包的一部分。

尽管本研究取得了积极成果，但仍存在局限性。首先，两种技术的效价结果评估均使用了单一制造商生产的商用兽用狂犬病疫苗批次，这些批次均已通过效价标准，且评估依据为兽用疫苗1IU/剂量的要求；对于未达标的疫苗批次，尚未开展额外评估。其次，尽管相关原理具有适用性，但将结果直接外推至人用疫苗（要求效价＞2.5IU/剂量）[4]或其他制造商生产的疫苗时，需谨慎对待，且最好有进一步的桥接数据支持。最后，本研究结果还依赖于所用的特定试剂（BHK-21细胞、CVS-7病毒、参考标准品）。

尽管获得监管机构的认可既非易事，也非一蹴而就，但整合内容完善、透明度高的验证材料包（如本研究呈现的材料包）至关重要——这有助于建立信任，并推动RFFIT作为NIH效价测试替代方法获得更广泛的认可。

为加快这一进程，我们建议由一家国际参考实验室牵头，协调那些常规使用这些方法的实验室开展多中心对比研究。此类研究应实现以下目标：（1）生成验证性数据集；（2）建立与通用参考材料的溯源关系；（3）统一可接受范围与报告格式。

本研究为实现该目标提供了支持；结合当前及未来将发表的相关研究，我们的数据充分表明，收集足够证据以支持向监管机构提交正式提案（建议将RFFIT列为可接受方法）不仅有必要，而且切实可行。

Tibavija SS, Almario MP, Jaramillo V, Rivera J, Chaparro CY, Paramo C, García DF, Ladino L, Suarez ZR. Validation and evaluation of the rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) for the quantification of neutralizing antibodies as an indirect measure of rabies vaccine relative potency: An alternative to the NIH test. Vaccine. 2025 Oct 3;64:127724. doi: 10.1016/j.vaccine.2025.127724. Epub 2025 Sep 10. PMID: 40934733.

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